Häufigkeit von Alterationen des P53-Tumor-suppressorgens an Nierenzellkarzinomen und Korrelation mit dem klinischen Stadium

Zusammenfassung

Für Nierenzellkarzinome wurden Alterationen des p53-Tumorsuppressorgens unter Verwendung verschiedener molekulargenetischer Analyseverfahren, einschließlich der SSCP- und direkten DNA-Sequenzanalytik, mit einer Häufigkeit von 6-60 % berichtet. Als Erklärung für diese deutlich variierende Frequenz wurde das durch tumorinfiltrierende Lymphozyten bzw. intratumorale Nekrosezonen verursachte genetische “Hinter-grundsignal” diskutiert. Zur Vermeidung solcher Hinter-grundsignale wurde im Rahmen der vorliegenden Untersuchung eine Technik etabliert, die auch die retrospektive Analyse von formalinfixiertem und in Paraffin eingebettetem Gewebe erlaubt. Für die molekulargenetische Analytik erfolgte die mikroskopisch kontrollierte Dissektion der Tumorzellen aus ihrem Zellverband entsprechend histopathologischen Kriterien. Zusätzlich orientierte sich die Mikrodissektion an der immunhistochemisch detektierten Überexpression des p53-Onkopro-teins, sowie an der immunhistochemischen Reaktion gegen das spezifisch an der Oberfläche von T-Lymphozyten exprimierte CD3-Antigen. Im Anschluß an die Mikropräparation von etwa 20-200 Tumorzellen wurden diese der PCR-gestützten RFLP-Analytik zugeführt. Diese stützte sich im wesentlichen auf den Nachweis des sog. VNTR-Polymorphismus, einer hochpolymorphen l00 bp-Markerregion in Intron 1 des p53-Gens. Zudem wurden die Tumoren nach mikrodissektorischer Gewebeextraktion mittels RNA-SSCP-Analytik untersucht. Im Falle eines Bandenshifts erfolgte die direkte DNA-Sequenzierung. Zusätzlich erfolgten alle Untersuchungen auch an lediglich entsprechend makroskopischen Kriterien extrahiertem Tumormaterial.An 9 von 33 (27 %) informativen Tumoren (Informativitätsgrad: 73 %) konnte ein Allelverlust für das p53-Gen detektiert werden. In 5 von 9 Fällen fand sich ein “loss of heterozygosity” an Tumoren höherer T-Stadien (>T2). Eine signifikante Korrelation zwischen der Detektion einer Alteration des p53-Tumorsuppressorgens und der histologischen Differenzierung oder dem T-Stadium der Karzinome wurde dabei nicht beobachtet. Nach Mikrodissektion des Gewebes ließ sich im Vergleich mit der Untersuchung des entsprechend makroskopischen Kriterien isolierten Zellmaterials in nur 2 zusätzlichen Fällen (VNTR-Polymorphismus) ein Allelverlust nachweisen. In der Univarianzanalyse (Log Rank-Test) wurden die Überexpression des p53-Onkoproteins (> 20 % Positivität), das Grading, der Lymphknotenstatus und der Nachweis von Fernmetastasen als Prognosefaktoren für den klinischen Verlauf identifiziert. In der Multivarianzanalyse erwies sich jedoch keine der untersuchten biologischen Variablen als unabhängiger prognostischer Parameter. Die Bedeutung des Nachweises einer Alteration des p53-Tumorsuppressorgens im Sinne eines additiven prognostischen Parameters erscheint daher für das Nierenzellkarzinom als eher unwahrscheinlich.

Abstract

Alterations of the p53 tumor suppressor gene have been identified in a variety of human malignancies including renal cancer. For renal cancer, utilizing moleculargenetic techniques including RFLP- and SSCP-analysis as well as subsequently performed DNA-sequencing, the occurrence of p53 gene alterations has been reported with largely varying frequency (6-60 %). This observation might be explained by the distortion of LOH- and SSCP-analysis due to “genetic background-signals”, which may result from non-tumor tissues such as tumor infiltrating lymphocytes and stromal components or necrosis inside the tumor tissues. Therefore, we have established a technique which even allows the retrospectively performed analysis of formalin fixed and paraffin embedded tumors and widely avoids a disturbance of moleculargenetic analysis due to such genetic “background signals”. Tumor areas were isolated from the tissue sections by a “scraping technique” according to histopathological criterias and the result of the immunohistochemical staining reaction for the p53 oncoprotein (pAb 1801) and the CD3 lymphatic surface antigen. Following the selection of 20-200 tumor cells, PCR directed molecular genetic analysis including a new highly informative allelo-typing approach for the detection of allelic loss (LOH), aiming at the detection of a marker directly localized in intron 1 of the p53 gene (VNTR-polymorphism), as well as the screening for mutations by single strand conformation polymorphism analysis (SSCP) in exons 5-8, followed by direct DNA-sequencing in case of band shifting during SSCP-analysis, was performed. Utilizing this approach 33 of 45 (73 %) renal cancers were informative for PCR-directed polymorphism analysis. Allelic loss at the p53 gene locus was observed in 9 of 33 cases (27 %). In 5 of 9 cases allelic loss at the p53 gene locus was observed in higher stage tumors (>pT2). A significant correlation between p53-gene alteration and the T-stage or the histological differentiation could not be observed. Compared with the moleculargenetic investigation of tumor tissue investigated following macroscopic criteria, only 2 additional tumor specimens revealed allelic loss at the p53 gene locus detected by LOH-analysis for VNTR-polymorphisms, when a microscopically directed scraping technique for tumor cells was used. During univariate analysis (log rank test) overexpression of the p53 oncoprotein (>20 % positivity) as well as the histological grade, the lymph node status and the presence of distant metastases could be identified as prognostic parameters for survival. However, during multivariate analysis none of the factors investigated remained as an independent prognosticator for survival. In summary, it seems unlikely that p53 gene alterations will serve as an important new prognostic factor for the clinical prognosis of the patients with renal cell cancer.

Key words

Renal cell cancer - p53 tumor suppressor gene - Prognostic factor - Microdissection technique