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DOI: 10.1055/s-0031-1297003
Expression, Purification, Biochemical and Pharmacological Characterization of a Recombinant Aprotinin Variant
Publication History
Publication Date:
25 December 2011 (online)
Summary
Aprotinin (CAS 9087-70-1) is known as a potent inhibitor of serine proteases such as trypsin, plasmin, tissue and plasma kallikrein. In this study, an aprotinin variant was designed by means of rationale mutagenesis that differs from aprotinin by two amino acids in the active site and by seven amino acids in the backbone. The recombinant protein is expressed in a secretory yeast system enabling large scale production. A purification procedure was developed to yield high amounts of pure and correctly processed aprotinin variant. The changes in the active site of the aprotinin variant increase the potency towards inhibition of plasma kallikrein whereas the inhibition of plasmin is only marginally reduced. The net charge of the molecule is reduced from the basic (IP 10.5) to the neutral range (IP 5.6).
The recombinant aprotinin variant shows a decrease of immunogenicity in several models. No cross-reactivity with human and rabbit antibodies directed against aprotinin was observed both in in vivo and in ex vivo studies.
In addition, the variant is more potent in a rat brain edema model of acute subdural hematoma compared to aprotinin.
Zusammenfassung
Expression, Reinigung sowie biochemische und pharmakologische Charakterisierung einer rekombinanten Aprotinin-Variante
Aprotinin (CAS 9087-70-1) gehört zur Familie der Kunitz-Typ-Inhibitoren und ist als potenter Inhibitor der Serinproteasen Trypsin, Plasmin, Gewebs- und Plasmakallikrein bekannt. Mit Hilfe eines rationalen Proteindesign-Ansatzes wurde eine Aprotinin-Variante hergestellt, die sich im Bereich des aktiven Zentrums in 2 Positionen und in der Peripherie des Moleküls in 7 Positionen von Aprotinin unterscheidet. Das rekombinante Protein wird in einem sekretorischen Hefe-System hergestellt. Ein Reinigungsverfahren wurde entwickelt, das in der Lage ist, die korrekt prozessierte Aprotinin-Variante mit hohen Ausbeuten zu isolieren.
Die Aminosäureaustausche im aktiven Zentrum führen zu einer Verbesserung der inhibitorischen Konstanten gegenüber Plasma-Kallikrein, während die Inhibition von Plasmin nahezu unverändert bleibt. Der isoelektrische Punkt der Aprotinin-Variante sinkt von ursprünglich 10,5 auf einen Wert von 5,6.
Die rekombinante Aprotinin-Variante zeigt in verschieden Modellen eine Abnahme der Immunogenität. Gegen Aprotinin gerichtete humane und Kaninchen-Antikörper zeigen keine Kreuzreaktion mit der Aprotinin-Variante sowohl in In-vivo- als auch in Ex-vivo-Studien. Außerdem zeigt die Aprotinin-Variante eine deutlich bessere Wirkung in einem Hirnödem-Modell der Ratte im Vergleich zu Aprotinin.
Außerdem zeigt die Aprotinin-Variante eine deutlich bessere Wirkung in einem Hirnödem-Modell der Ratte im Vergleich zu Aprotinin.