Analyse der differentiellen Genexpression in Neuronen bei demyelinisierenden hereditären Neuropathien: Kombination von Laser-Mikrodissektion und Affymetrix-GeneChip-Analyse (IZKF Münster, Projektnr. You3/016/06)

Primär demyelinisierende hereditäre Neuropathien sind mit einer konsekutiven axonalen Degeneration verbunden, die eine wesentliche Rolle im klinischen Verlauf der Erkrankung spielt. Die molekularen Grundlagen der axonalen Degeneration, d.h. die Konsequenzen der primären Demyelinisierung für die Neurone bzw. Axone, sind bislang weitgehend unbekannt.

Um die differentielle Genexpression in Neuronen zu erfassen, wird eine Kombination von Laser-Mikrodissektion (LMD) und GeneChip-Technologie eingesetzt. Als tierexperimentelles Modell werden Mäuse mit einer veränderten Gendosis für das periphere Myelinprotein 22 (PMP22) verwendet, die in Analogie zu PMP22-assoziierten Neuropathien beim Menschen eine primäre Demyelinisierung mit sekundärer axonaler Degeneration aufweisen. Per LMD werden motorische Vorderhornneurone isoliert, RNA extrahiert und die Genexpression in Motoneuronen (MN) durch GeneChip-Analyse sowie quantitativer Real-Time-PCR (qRTPCR) untersucht.

Mittels LMD konnten wir aus PMP22-überexprimierenden, PMP22-defizienten und Wildtyp-Mäusen MN des spinalen Vorderhorns der Segmenthöhe L1-L2 isolieren. Dazu wurden Kryoschnitte (16 um) von 4–5 Tieren pro Gruppe des o.g. Rückenmarkbereichs angefertigt, mit Toluidinblau gefärbt und der LMD unterzogen. Die Anzahl isolierter Zellen betrug im Durchschnitt 2300 MN pro Tier. Dieser Probenumfang erwies sich als notwendig, um für die GeneChip-Analysen und qRTPCR-Studien genügend RNA zu erhalten. Durch Optimierung der Isolierungsprotokolle wurde qualitativ geeignete RNA mit einer RIN (RNA integrity number) von 7–8 (Agilent 2100 Bioanalyzer) erhalten, die für GeneChip- bzw. für qRTPCR-Studien erfolgreich in cRNA bzw. cDNA revers transkribiert wurde. Nach Markierung der cRNA konnten die Hybridisierungen auf Mouse Genome-Chips (Affymetrix) für alle Untersuchungsgruppen erfolgreich abgeschlossen werden. Zur Zeit erfolgt die bioinformatische Auswertung der gewonnenen Expressionsdaten.

Durch Anwendung der LMD und molekularbiologischer Methoden konnten wir cRNA aus isolierten Motoneuronen gewinnen, die qualitativ und quantitativ zur Hybridisierung auf GeneChips geeignet ist. Mithilfe der Kombination von LMD und GeneChip-Technologie bietet sich damit die Möglichkeit, die differentielle Genregulation in isolierten Neuronen verschiedener Modelle neuromuskulärer Erkrankungen (HMSN, ALS u.a.) zu analysieren.

Das Projekt wird gefördert durch das IZKF Münster (You3/016/06).