Efomycine: Anti-entzündliche Therapie durch Hemmung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion

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Zusammenfassung

Da Selektin-vermittelte Adhäsion an Endothelzellen (sog. Rollen) ein Schlüsselschritt bei der Rekrutierung von Leukozyten in entzündeten Geweben ist, ist die gezielte Hemmung dieser Interaktionen ein vielversprechender Ansatz zur gezielten Therapie entzündlicher Erkrankungen. E- und P-Selektin werden von Endothelzellen und L-Selektin wird von Leukozyten exprimiert. Auf der Suche nach kleinmolekularen Substanzen, die Selektin-vermittelte Leukozyten-Adhäsion an Endothelzellen gezielt beeinflussen, zeigte Efomycin M, ein halbsynthetisches Makrolid, eine sehr gute Hemmung der E- und P-Selektin-vermittelten Adhäsion. Dies resultierte in signifikant vermindertem Rollen von Lymphozyten in vivo sowie in einer sehr guten therapeutischen Wirksamkeit in zwei komplementären Mausmodellen der Psoriasis, einer häufigen chronisch entzündlichen Hauterkrankung. Auf molekularer Ebene konnte gezeigt werden, dass Efomycine, obwohl chemisch nicht verwandt, Strukturanaloga des natürlichen Selektin-Liganden Sialyl-LewisX sind und wahrscheinlich dadurch ihre anti-entzündliche und anti-adhäsive Wirkung entfalten. Insgesamt sind Efomycine eine interessante neue Substanzfamilie, deren Wirkprinzip eine selektive Beeinflussung verschiedener Entzündungsprozesse - nicht nur in der Haut - erwarten lässt.

Abstract

Given that selectin-mediated adhesive interactions between leukocytes and endothelial cells (i. e., rolling) are the crucial initial step in the cascade of events leading to leukocyte recruitment to inflammatory sites, selective inhibition of these interactions may be a promising target for selective anti-inflammatory therapies. E- and P-selectin are expressed by endothelial cells, while L-selectin is expressed by various leukocytes. When small-molecule compounds were screened for their capacity to inhibit selectin-mediated leukocyte-endothelial cell interactions, the macrolide, efomycine M, was found to exert profound inhibitory effects on both E- and P-selectin-mediated adhesion. This resulted in significantly diminished leukocyte rolling in vivo as well as in marked therapeutic efficacy in two complimentary mouse models of psoriasis, a common chronic inflammatory skin disorder. On the molecular level, efomycines are structural analogues of sialylated LewisX, a natural selectin ligand, although both compounds are chemically unrelated. Overall, efomycines are an interesting new family of compounds whose mode of action may prove relevant for selective therapies of various inflammatory disorders.

Leukozyten-Endothel-Adhäsion: Ein Schlüsselschritt bei der Pathogenese entzündlicher Erkrankungen

Leukozyten-Adhäsion an Endothelien, die durch Zytokine, Chemokine und andere Mediatoren gesteuert wird, ist essenziell für die Immunüberwachung in gesunden Geweben sowie für die Pathogenese entzündlicher Erkrankungen. Da der initiale Kontakt von Leukozyten und Endothelzellen unabdingbar für die Pathogenese zahlreicher entzündlicher Erkrankungen ist, sind diese adhäsiven Funktionen interessante therapeutische Zielstrukturen [1].

Die ersten Schritte der Leukozyten-Lokalisation in sämtlichen Geweben sind das lockere Anheften („Tethering”) und das Rollen („Rolling”), transiente adhäsive Interaktionen zwischen Leukozyten und vaskulären Endothelien, die in erster Linie durch Selektine vermittelt werden [2] [3] [4] [5] [6] [7]. Selektine sind einkettige Transmembran-Proteine, die mittels lektinartiger Domänen (daher der Name) an proteingebundene Kohlenhydrat-Strukturen auf anderen Zellen binden [8] [9] [10].

Insgesamt sind drei homologe Selektine bekannt: E- und P-Selektin, die von Endothelzellen exprimiert werden sowie L-Selektin, das von verschiedenen Leukozyten exprimiert wird. Aktivierte Endothelzellen können sehr schnell P-Selektin (CD62P) an die Zelloberfläche mobilisieren [11] [12], während die Expression von E-Selektin (CD62E) transkriptionell reguliert wird [13] [14]. Chemokine und ihre Rezeptoren können die Selektin-Funktion sehr rasch modulieren [15]. Die zentrale pathogenetische Rolle der beiden endothelialen Selektine für entzündliche Erkrankungen wurde in mehreren experimentellen Studien bestätigt, in denen die Blockade der selektinvermittelten Adhäsion auch therapeutisch genutzt wurde [1] [16]. Kürzlich wurde allerdings eine klinische Studie veröffentlicht, in der ein funktionsblockierender monoklonaler Antikörper gegen E-Selektin keine signifikante Aktivität in der Behandlung von Psoriasis-Patienten zeigte [17]. Diese klinische Beobachtung legte nahe, dass spezifische Blockade eines einzigen Selektins zur Unterbrechung der Entzündungskaskade und somit zur erfolgreichen Unterdrückung von Entzündungsvorgängen nicht ausreicht. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese zeigen mehrere Studien tatsächlich teilweise redundante bzw. überlappende Funktionen von E- und P-Selektin [18] [19] [20]. Die therapeutische Wirksamkeit der hier vorgestellten Efomycine ist deshalb möglicherweise dadurch bedingt, dass die Funktion beider Selektine, E- und P-Selektin, gehemmt wird.

L-Selektin (CD62L) wird von naiven und zentralen Memory-T-Zellen exprimiert und vermittelt Adhäsion an endotheliale Selektin-Liganden. Diese Liganden, beispielsweise PNAd, können in chronisch-entzündlichen Hauterkrankungen auf Endothelzellen induziert sein [21]. Die bevorzugte Lokalisation von L-Selektin auf den Spitzen der Mikrovilli rollender Leukozyten scheint hierbei eine wichtige Rolle für den initialen Kontakt und somit die Ligandenbindung zu spielen [22]. Außerdem scheint die rasche proteolytische Abspaltung von L-Selektin von der Leukozyten-Oberfläche durch Metalloproteasen [23] [24], ein als „Shedding” bezeichneter Prozess, wichtig für das Rollen der Lymphozyten zu sein [25]. Die regulatorische Funktion des „Shedding” wird beispielsweise dadurch deutlich, dass Inhibition dieses Vorganges zu verstärkter fester Leukozyten-Adhäsion am Gefäßendothel und somit zu gesteigerter Transmigration führt [26].

Die Sialyl-Lewis^X (sLe^X) enthaltenden Glycoprotein-Liganden für endotheliale Selektine werden von verschiedenen Leukozyten, beispielsweise T-Lymphozyten, ebenfalls exprimiert [10]. T-Zellen, die in die Haut lokalisieren, exprimieren meist den sLe^X-enthaltenden Selektin-Liganden CLA (cutaneous lymphocyte-associated antigen), eine spezielle Glycosylierungsform von PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand-1, CD162) [27]. CLA ist wahrscheinlich an der gewebespezifischen kutanen Lymphozyten-Rekrutierung beteiligt [28] [29], wobei CLA-exprimierende T-Zellen bevorzugt durch das Endothel des oberflächlichen dermalen Plexus extravadieren [30]. Dies legt eine topografische Spezialisierung des dermalen mikrovaskulären Gefäßendothels hinsichtlich selektinvermittelter Adhäsion nahe.

Zusätzlich zu selektinvermitteltem Rollen der Leukozyten können auch heterodimere Adhäsionsrezeptoren aus der Integrin-Familie das Rollen mancher Lymphozyten vermitteln. Insbesondere das α₄β₁-Integrin (VLA-4, CD49d/CD29), das an Liganden aus der Immunglobulin-Superfamilie bindet (z. B. VCAM-1 [vascular cell adhesion molecule-1] und MAdCAM-1 [mucosal addressin cell adhesion molecule-1]), ist hier zu nennen [31] [32] [33]. Die Funktion beim Lymphozyten-Rollen besteht zusätzlich zu der bekannten Funktion bei fester endothelialer Adhäsion und beruht zum Teil ebenfalls auf der bevorzugten Präsentation des α₄β₁-Integrins auf den Mikrovilli rollender Leukozyten [33]. Das Integrin α₄β₁ wirkt hier synergistisch mit Selektinen zusammen [34].

Aus der geschilderten Funktion endothelialer und leukozytärer Adhäsionsmoleküle bei Rollen und Anheftung zirkulierender Leukozyten wird deutlich, dass insbesondere Selektine eine Schlüsselrolle bei diesen sehr frühen Schritten der Pathogenese entzündlicher Erkrankungen (beispielsweise autoimmunologisch vermittelter oder allergischer Erkrankungen) in nahezu sämtlichen Organen spielen. Dies macht Selektine zu interessanten molekularen Zielstrukturen bei der selektiven Behandlung dieser Erkrankungen.

Efomycine blockieren Leukozyten-Adhäsion in vitro

Auf der Suche nach kleinmolekularen Substanzen, die die selektinvermittelte Leukozyten-Adhäsion vermindern, wurden insgesamt 20 000 verschiedene Substanzen in einem HTS-(High Throughput Screening-)Verfahren untersucht. In diesen initialen Experimenten zeigte Fermentationsmaterial von Streptomyces BS1261 die gewünschte Aktivität - es blockierte die Adhäsion aktivierter Thrombozyten an neutrophile Granulozyten in einem weiten Konzentrationsbereich zwischen 10 ^{- 4} und 10 ^{- 7} M. Durch Aufreinigung der Komponenten dieses Rohmaterials mittels HPLC (High-Performance Liquid Chromatography), Dünnschichtchromatographie, Reversphasen-HPLC und FAB-(Fast Atom Bombardment)-Massenspektroskopie wurde gezeigt, dass das ursprüngliche Fermentationsmaterial vier Makrolide enthielt, die Efomycine A, B, E und G genannt wurden [35]. Schließlich wurden weitere Mitglieder der Efomycin-Familie synthetisiert, beispielsweise entstand Efomycin M durch β-Elimination der Deoxyfucose-Ketten.

In Adhäsionsexperimenten zeigte sich, dass die Leukozyten-Adhäsion an Nabelschnur-Endothelzellen, dermale Endothelzellen oder das Endothel der Schweine-Aorta durch Efomycine M, E und G, nicht hingegen A und B, signifikant unterdrückt wurde. Insbesondere Efomycin M beeinflusste selektiv die Leukozyten-Adhäsion an Endothelien und zeigte keine Inhibition der Adhäsion an eine Albumin-Matrix.

Um die molekularen Grundlagen der anti-adhäsiven Wirkung von Efomycin M genauer aufzuklären, wurde einerseits die Adhäsion von CEA (enthält Sialyl-Lewis^X) an r-(rekombinantes)-E-Selektin und andererseits die Leukozyten-Adhäsion an r-P-Selektin untersucht. Es zeigte sich eine signifikante konzentrationsabhängige Blockade beider Selektine, wobei die Wirkung bei E-Selektin vergleichsweise stärker war als bei P-Selektin. Da Efomycin M darüber hinaus eine sehr geringe Toxizität zeigte, wurde es in den folgenden Experimenten in vivo eingesetzt, um seine Aktivität beim Rollen von Lymphozyten zu untersuchen:

Efomycin M hemmt Leukozyten-Rolling in vivo

Die Aktivität von Efomycin M in vivo wurde mithilfe intravital fluoreszenzmarkierter menschlicher T-Zellen untersucht, die in die A. carotis communis anästhesierter Mäuse injiziert wurden. Diese Zellen zirkulieren im Blutkreislauf des Wirtes und können durch Intravitalmikroskopie in den Ohrkapillaren direkt in vivo nachgewiesen werden. Auf Videoaufzeichnungen der mikroskopierten Kapillaren können dann sämtliche in einem definierten Gefäßareal im Blutstrom passierenden, rollende sowie fest adhärierende markierte Zellen quantifiziert werden.

Durch einmalige i. v. Applikation von 5 mg/kg Efomycin M wurden die rollenden Lymphozyten sofort um etwa 70 % reduziert, wodurch die In-vivo-Wirksamkeit eindrucksvoll belegt wurde. Dass dies ein selektinspezifischer Effekt war, wurde durch komplementäre Blockade-Experimente mit funktionsblockierenden Antikörpern gegen P- und E-Selektin gezeigt.

Efomycin M bessert murine psoriasiforme Hautentzündungen

Die Inhibition des Leukozyten-Rollens durch Efomycin M deutete bereits an, dass diese Substanz bei Erkrankungen, bei denen die Leukozyten-Rekrutierung zu entzündeten Geweben eine entscheidende pathogenetische Rolle spielt, therapeutisch genutzt werden könnte. Um diese Hypothese direkt in vivo zu überprüfen, wurde die Psoriasis bzw. psoriasiforme hyperproliferativ-entzündliche Hautläsionen als „Modellerkrankung” untersucht. Psoriasis ist eine häufige chronisch-entzündliche Hauterkrankung, an der bis zu 3 % der Bevölkerung leiden [36]. Es handelt sich um eine primär T-Zell-vermittelte Erkrankung, bei der auch neutrophile Granulozyten eine wichtige Rolle spielen [36]. In zwei komplementären präklinischen Modellen der Psoriasis wurde die Wirksamkeit von Efomycin M überprüft:

Das erste Modell basiert auf Rekonstitution von SCID-Mäusen mit Minor-HC-verschiedenen naiven CD4⁺-T-Zellen (CD4⁺/ CD45RB^hi-T-Zellen). Die Empfängertiere zeigen eine massive T-Zell-Dysregulation, die zu einer protrahierten GVHD mit Colitis sowie einer psoriasis-artigen Hautentzündung führt [37] [38]. Dieses Modell ist immunologisch vermittelt, ohne dass primäre epitheliale Abnormalitäten vorhanden sind. Im zweiten Modell wurde läsionale Haut von Psoriasis-Patienten auf SCID-Mäuse transplantiert, wobei der psoriatische Phänotyp erhalten bleibt und für Therapiestudien genutzt werden kann [39] [40] [41]. Beide Modelle wurden bereits zur Evaluation verschiedener anti-inflammatorischer Therapiemodalitäten erfolgreich eingesetzt.

In beiden Modellen wurden die Versuchstiere durch wiederholte Injektionen von 5 mg/kg Efomycin M behandelt, und in beiden Modellen zeigte sich unter dieser Therapie eine rapide und dramatische Besserung der Hautläsionen, ohne dass während Beobachtungszeiträumen von bis zu 7 Wochen unerwünschte Wirkungen nachweisbar waren [35]. In diesen präklinischen „proof-of-principle”-Untersuchungen wurde somit das therapeutische Potenzial von Efomycin M bestätigt.

Efomycin M ist ein Sialyl-Lewis^X-Strukturmimetikum

Um Struktur-Wirkungs-Beziehungen aufzuklären, wurde Efomycin M mit dem natürlichen Selektin-Liganden Sialyl-Lewis^X [10] verglichen. In NMR-Spektroskopie- und computergestützten „Modelling”-Untersuchungen wurde gezeigt, dass Efomycin M hinsichtlich der für die Selektin-Bindung relevanten Gruppen eine sehr ähnliche Struktur wie der chemisch nicht verwandte natürliche Selektin-Ligand Sialyl-Lewis^X besitzt [35]. Diese strukturelle Ähnlichkeit könnte der Schlüssel für die selektiven Wirkungen in vitro und in vivo sein (Abb. [1]).

Abb. 1 Dreidimensionale Strukturen von Efomycin M und dem natürlichen Selektin-Liganden Sialyl-Lewis^X. In der Superposition beider Strukturen fällt die ähnliche dreidimensionale Anordnung der für die Selektin-Bindung relevanten Gruppen auf (gelbe Rechtecke).

Ausblick

Da selektinvermitteltes Rollen für verschiedene Gruppen von Leukozyten relevant ist, könnte Efomycin M an unterschiedlichen Stellen pathogenetischer Kaskaden eingreifen. Außerdem werden die Moleküle, deren Funktion durch Efomycin M gehemmt wird (E- und P-Selektin), präferenziell in entzündeten Geweben heraufreguliert. Man kann deshalb vermuten, dass (Neben-)Wirkungen an anderen Stellen des Organismus gering sind. Schließlich sind generelle immunsuppressive Wirkungen und pleiotrope Effekte wie bei anderen Immunsuppressiva (beispielsweise Glukokortikosteroide oder Cyclosporin A) für Efomycin M bisher nicht bekannt. Die anti-entzündliche Wirkung von Efomycin M dürfte deshalb vergleichsweise selektiv sein - sowohl im Hinblick auf die molekularen Interaktionen, die beeinflusst werden, als auch im Hinblick auf die Lokalisation im behandelten Organismus. Insgesamt sind Efomycine also eine interessante neue Substanzklasse, deren Wirkprinzip - Selektin-Blockade - ein über entzündliche Hauterkrankungen hinausreichendes Indikationsspektrum erwarten lässt. Weiterführende Studien werden diese Hypothesen überprüfen.

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