Avaliação dos efeitos da natação como reabilitação pós-operatória na regeneração nervosa de ratos da linhagem Wistar submetidos a enxerto de nervos autólogos após lesão do nervo ciático^[*]

Resumo

Objetivo Avaliar os efeitos da natação na regeneração nervosa após a lesão do nervo ciático em ratos Wistar.

Métodos Um total de 30 ratos Wistar foram divididos em 3 grupos: grupo Sham + Nat: animais que não foram submetidos à cirurgia de enxerto e foram submetidos à natação (n = 10); grupo Enxerto: animais que foram submetidos à cirurgia de enxerto autólogo de nervo ciático (n = 10); e grupo Enx + Nat: animais submetidos à cirurgia de enxerto autólogo de nervo ciático e à natação (n = 10). Os resultados foram analisados pelo software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).

Resultados Na primeira avaliação, todos os valores do índice funcional do ciático (IFC) foram semelhantes (p = 0.609). Após 30 dias do procedimento cirúrgico, foram observadas diferenças entre todas as comparações: Sham + Nat (−34,64 ± 13,89) versus Enxerto (−145,9 ± 26,06), grupos Sham + Nat versus Enx + Nat (−89,40 ± 7,501), grupos Enxerto (−145,9 ± 26,06) versus Enx + Nat (−89,40 ± 7,501). Nas medidas (60 e 90 dias), não houve diferença estatística entre os grupos Enxerto e Enx + Nat, com valores significativamente menores em relação ao grupo controle (p < 0,001). O número de motoneurônios apresentou diferenças nas comparações entre os grupos Sham + Nat e Enxerto (647,1 ± 16,42 versus 563,4 ± 8,07; p < 0,05) e Sham + Nat e Enx + Nat (647,1 ± 16,42 versus 558,8 ± 14,79; p < 0,05), não havendo diferença entre os grupos Enxerto e Enx + Nat.

Conclusão Os animais submetidos ao protocolo de natação após o procedimento de enxerto do nervo ciático não apresentaram diferenças nos valores de IFC e nos números de motoneurônios quando comparados com grupo controle. Portanto, este tipo de protocolo não é eficiente para reabilitação de lesões nervosas periféricas que necessitam de enxerto, sendo necessários novos estudos.

Palavras-chave

traumatismos dos nervos periféricos - regeneração nervosa - natação - nervo ciático

Introdução

As lesões dos nervos periféricos são frequentes na prática clínica e representam um problema de saúde capaz de gerar incapacidade na população.[1] Os fatores etiológicos mais associados às lesões incluem: acidente automobilístico, lesão penetrante, e lesões relacionadas ao esporte.[2]

Morfologicamente, ocorre um aumento no tecido conjuntivo intramuscular e atrofia muscular evidenciada pela diminuição na área da secção transversal das fibras musculares.[3] Tais alterações causam dor e sensibilidade ao longo da fibra nervosa,[4] que podem resultar em limitações aos pacientes.

Apesar dos nervos periféricos possuírem a capacidade de regeneração,[5] a recuperação é criticamente dependente do tratamento pós-lesão.[1] Tratamentos não cirúrgicos, como o exercício físico, podem atuar na regeneração nervosa periférica.[4]

O exercício físico executado no ambiente aquático induz efeitos fisiológicos que proporcionam benefícios aos sistemas cardiovascular, esquelético, muscular e nervoso que aumentam o processo de reparação tecidual.[6] A natação auxilia na regeneração do nervo ciático em coelhos,[7] peixes[8] e ratos.[9] [10] [11] Esta parece atuar na remoção da mielina degenerada e na sua síntese na fase regenerativa,[7] acelerando a recuperação nervosa.[10] [11]

A imersão em ambientes aquáticos gera efeitos fisiológicos, como a elevação geral na temperatura corporal. À medida que a pele se torna aquecida, os vasos sanguíneos superficiais dilatam, o suprimento sanguíneo periférico é aumentado, e a frequência cardíaca eleva. O calor advindo da água reduz a sensibilidade das terminações nervosas sensitivas, auxiliando no alivio da dor e na redução do espasmo muscular.[12] [13] Embora haja estudos que tenham mostrado que a natação não promove benefícios na recuperação sensorimotora de ratos após a lesão do nervo ciático.[14] [15]

Os efeitos da natação na regeneração nervosa são conflitantes, pois alguns autores relataram que os exercícios forçados podem ter efeitos prejudiciais, especialmente no restabelecimento da função muscular.[16] [17] O estresse induzido pelo treinamento físico poderia impedir a recuperação funcional após lesão nervosa.

Devido às controvérsias científicas dos benefícios da natação, são necessários estudos que mostrem os efeitos desta atividade física na regeneração do nervo ciático. Neste contexto, o presente estudo tem como objetivo avaliar os efeitos da natação na regeneração nervosa após lesão do nervo ciático em ratos da linhagem Wistar.

Materiais e Métodos

Casuística

Foram utilizados 30 ratos machos da linhagem Wistar provenientes do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais, com idade de entre 7 e 8 semanas, pesando em média 250 g. Os animais foram mantidos em condições controladas de iluminação (ciclo claro/escuro de 12 horas), temperatura controlada (21 ± 2°C) e livre acesso à água e ração. Todos os animais foram mantidos em biotério até o momento da eutanásia.

O presente trabalho seguiu as normas da legislação vigente para experimentação animal, de acordo com as com as normas nacionais e a legislação internacional (Diretrizes do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, COBEA; Guia dos Institutos Nacionais da Saúde [NIH, na sigla em inglês] para Cuidados e Uso de animais de laboratório). O presente trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA), sob o número 5060051217).

Definição dos grupos de estudos

Os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos:

• SHAM + NATAÇÃO (Sham + Nat) – Animais que foram submetidos ao procedimento cirúrgico, sem retirada de enxerto, e foram submetidos à natação (n = 10);

• ENXERTO (Enxerto) – Animais que foram submetidos à cirurgia de enxerto autólogo de nervo ciático (n = 10);

• ENXERTO + NATAÇÃO (Enx + Nat) – Animais submetidos à cirurgia de enxerto autólogo de nervo ciático e à natação (n = 10).

Procedimento cirúrgico

No grupo Sham + Nat, o nervo ciático direito foi exposto por 10 minutos, e a camada muscular foi suturada com nylon monofilamentar 4-0 (Monofilamento preto NY44CT30, Tecnofil, Goiânia, GO, Brasil). Nos outros grupos, o nervo ciático foi cortado e um segmento de 8 mm foi ressecado, deixando um coto distal ∼ 3 mm antes da ramificação nervosa, como descrito por Fernandes et al.[18] O segmento do nervo, agora considerado enxerto de nervo, foi invertido e suturado com 2 pontos de fio monofilamentar 10-0 (Microcirurgia preto N-10005, Techsuture, Bauru, SP, Brasil).[19] A pele e o músculo foram suturados com fio monofilamentar de nylon 4-0 (Monofilamento preto NY44CT30, Tecnofil, Goiânia, GO, Brasil), e a operação foi encerrada.

Pós-operatório

Após a cirurgia, os ratos foram mantidos em gaiolas, submetidos à dieta padrão do biotério, água ad libitum, e a um ciclo claro/escuro de 12 horas. O tratamento imediato foi realizado com a administração de cloridrato de tramadol (5mg/kg, intraperitoneal). Em seguida, foi disponibilizado o tratamento com paracetamol e cetoprofeno por via oral adotando a dose preconizada para ratos de 1,5 mg/ml e 5mg/kg, respectivamente, a cada 24 horas, durante ≥ 5 dias, se houvesse sinais de dor.

Avaliação da marcha

A avaliação da marcha foi realizada antes do procedimento cirúrgico (tempo 0) e após 30, 60 e 90 dias. Os animais foram avaliados através do sistema CatWalk XT (Noldus Information Technology Inc., Leesburg, VA, EUA), que analisa pegadas através de uma passarela transparente acoplada a um sistema de computador. Estas pegadas foram utilizadas para calcular o índice funcional do ciático (IFC).[19]

Protocolo da natação

Os ratos dos grupos Sham + Nat e Enx + Nat foram colocados em uma piscina de 55 cm de altura, a mesma foi preenchida com 150 litros de água a uma temperatura de 30 ± 2°C, e os ratos foram induzidos a nadar. Antes do procedimento cirúrgico, os animais passaram por um período de adaptação progressiva durante 5 dias, iniciando o treinamento com 20 minutos até atingir 1 hora de natação. O exercício de natação foi iniciado no 14° dia após a cirurgia, com duração de 2 semanas, no qual os animais nadaram 30 minutos por 5 vezes na semana. Após esta etapa, os animais executaram a atividade de natação por 9 semanas seguindo o cronograma de 30 minutos por 3 vezes na semana.[9]

Cirurgia para marcação neuronal

A marcação neuronal foi realizada com o marcador neuronal retrógrado Fluoro-Gold (Fluorochrome, LLC, Denver, CO, USA), em uma concentração de 3%, no mesmo procedimento, através da exposição do coto proximal, distal à 2ª sutura do nervo durante 90 minutos, para posterior contagem dos neurônios no corno anterior da medula.[20]

Perfusão transcardíaca e extração da medula espinhal

A perfusão transcardíaca foi realizada 48 horas após a marcação neuronal, através de abertura da caixa torácica e exposição do coração. O ventrículo esquerdo foi puncionado com agulha e as soluções infundidas foram drenadas através de uma secção do átrio direito. Durante a perfusão, foram utilizadas as soluções tampões fosfato 0,2M, paraformaldeído 4% e sacarose 10%, em pH fisiológico.[20]

Imediatamente após a perfusão, foi realizada a laminectomia e um segmento da medula espinhal foi removido, usando um microscópio cirúrgico (MCT MU-M 19, DFVasconcelos, São Paulo, SP, Brasil). As raízes de L3 e S1 foram identificadas na origem e seccionadas transversalmente de modo a manter os segmentos L4, L5 e L6 intactos. Os segmentos da medula espinhal foram crioprotegidos em sacarose 20% e seccionados em criostato em uma espessura 40 µm. As fatias foram montadas em lâminas de vidro e analisadas por microscopia de fluorescência.[18]

Análise histológica do segmento de medula

Para a análise histológica, foi feito um estudo quantitativo de neurônios marcados pelo marcador neuronal retrógrado Fluoro-Gold no corno anterior da medula. Utilizando os aumentos de 25, 50, 100 e 400 vezes do microscópio de fluorescência ZEISS Axiolab (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemanha), todas as secções foram examinadas e os motoneurônios marcados foram computados. Todas as análises foram realizadas pelo mesmo examinador. A análise histológica foi realizada aleatoriamente na medula de cinco animais de cada grupo. Nesta, foram consideradas apenas as células fortemente positivas para Fluoro-Gold, sendo utilizado o critério de correção de Abercrombie (1946) apud Fernandes et al.[20]

Análise Estatística

Os resultados foram avaliados no programa GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). O teste de Shapiro-Wilk foi usado para determinar a normalidade da distribuição de dados. As variáveis paramétricas entre os três grupos foram determinadas pelo teste de análise de variância (ANOVA) com correção pelo pós-teste de Bonferroni. Foram consideradas diferenças estatisticamente significativas os valores de p ≤ 0,05.

Resultados

Índice Funcional do Ciático

Na primeira avaliação, todos os valores do IFC foram semelhantes entre os grupos Sham + Nat (−17,78), Enxerto (−20,64) e Enx + Nat (−14,184), com p = 0,6099.

O grupo Sham + Nat obteve os índices nos limites da normalidade em todas as mensurações, permanecendo seus valores negativos e próximos do zero. Após o procedimento cirúrgico, os valores de IFC nos grupos experimentais (Enx e Enx + Nat) foram significativamente menores do que os do grupo Sham + Nat (p < 0,001; [Tabela 1]; [Figura 1]). Nos grupos Enx e Enx + Nat, como o esperado, a 1ª mensuração após a cirurgia de enxerto exibiu uma queda brusca nos valores do IFC30 (−145,9 ± 26,06 e −89,40 ± 7,501, respectivamente).

Fig. 1 Análise do índice funcional do ciático entre os grupos Sham + Natação, Enxerto e Enxerto + Natação nos tempos de 0, 30, 60 e 90 dias.

Tabela 1

Tempo	Grupo	Média	DP	Mediana	Mínimo	Máximo	n	valor-p
0	Sham + Natação	−17,78	17,27	−24,27	−25,74	24,82	8	0,6099
	Enxerto	−20,64	9,679	−18,82	−35,16	−8,360	9
	Enxerto + Natação	−14,18	13,46	−17,83	−25,57	−25,57	9
30	Sham + Natação	−34,64	13,89	−32,41	−50,20	−13,79	7	p < 0,0001*
	Enxerto	−145,9	26,06	−143,3	−190,2	−100,4	10
	Enxerto + Natação	−89,40	7,501	−89,03	−100,2	−74,30	9
60	Sham + Natação	−26,97	13,28	−20,28	−50,12	−13,32	7	p < 0,0001#
	Enxerto	−77,52	11,34	−80,24	−91,15	−58,36	10
	Enxerto + Natação	−84,69	21,65	−91,44	−102,6	−27,64	10
90	Sham + Natação	−19,11	11,33	−21,26	−36,82	−2,870	8	p < 0,0001#
	Enxerto	−72,14	19,50	−73,37	−107,5	−41,16	10
	Enxerto + Natação	−84,27	5,782	−83,74	−92,28	−75,10	8

No seguimento pós-operatório (60 e 90 dias), os 2 grupos enxertados tiveram uma melhora funcional progressiva, embora ainda inferiores à do grupo Sham + Nat (p < 0,0001), sem diferenças entre os grupos Enx e Enx + Nat. No IFC60, os grupos Enx e Enx + Nat apresentaram melhora nos valores de IFC (−77,52 ± 11,34 e −84,69 ± 21,65, respectivamente), e estes apresentaram valores semelhantes no IFC90 (−72,14 ± 19,50 e −84,27 ± 5,78, respectivamente).

Histologia da medula (contagem de motoneurônios)

De acordo com o número de motoneurônios, podemos observar que houve diferença nas comparações entre os grupos Sham + Nat e Enxerto (647,1 ± 16,42 versus 563,4 ± 8,07; p < 0,05) e entre os grupos Sham + Nat e Enx + Nat (647,1 ± 16,42 versus 558,8 ± 14,79; p < 0,05), não havendo diferença entre os grupos Enxerto e Enx + Nat ([Figura 2]).

Fig. 2 Valores da contagem de motoneurônios após correção pelo fator Abercrombie. Foram avaliados 30 animais divididos nos seguintes grupos: Sham + Natação (n = 10), Enxerto (n = 10), e Enxerto + Natação (n = 10), nos tempos de 0, 30, 60 e 90 dias. Teste de análise da variância (ANOVA) com correção pelo pós-teste de Bonferroni. * Foram encontradas diferenças entre as comparações (Sham + Natação versus Enxerto, Sham + Natação versus Enxerto + Natação), foram consideradas diferenças estatisticamente significativas valores-p ≤ 0,05.

Discussão

A natação é um exercício de reabilitação para tratar a lesão nervosa. Porém, o nível eficaz de resistência e de duração do exercício ainda não é claro.[11]

A natação foi aplicada nos ratos 14 dias após o procedimento cirúrgico, pois a reinervação funcional dos músculos inicia ∼ 2 ou 3 semanas após o esmagamento do nervo ciático em ratos. O excesso de trabalho do músculo antes deste período pode ser prejudicial à recuperação.[16] [21] [22]

Os estudos que avaliam a neurorrafia término-terminal sem enxerto geralmente utilizam protocolos de reabilitação durante 4 semanas do pós-operatório[21] [23] [24] ou um período menor.[25] Pela aplicação do enxerto demonstrar pior prognóstico e uma recuperação clínica mais lenta, nós adotamos um aumento do período de exposição dos animais à natação.

No presente estudo, não foi observada nenhuma diferença clínica medida através do IFC. Os valores obtidos, entre 0 e −20, no período pré-operatório, refletiam uma função normal.[26] Em nosso estudo, os valores de IFC próximos a -100 no grupo enxerto aos 60 dias apresentaram comprometimento completo da função nervosa, sugerindo ausência de inervação nesse período. Nas demais avaliações, os valores dos grupos Enxerto e Enxerto + Natação se tornaram menos negativos, indicando retorno gradual da função.[15] O grupo Enxerto e Enx + Nat apresentaram um IFC menos negativo em 90 dias após o pós-operatório, mas este se distanciou dos valores apresentados pelo grupo controle.

Ilha et al[21] observaram uma melhora precoce dos valores do IFC em animais submetidos ao exercício físico pós-cirurgia de esmagamento do nervo ciático quando comparados aos ratos sedentários.

Teodori et al[9] avaliaram os aspectos morfológicos e as características funcionais dos nervos ciáticos de ratos e relataram que os animais submetidos à natação imediatamente após a lesão do nervo por esmagamento e animais submetidos à natação após 14 dias da lesão apresentaram menor número de axônios e maior diâmetro dos axônios e das fibras nervosas que animais controles, sugerindo que o exercício pode ser iniciado imediatamente após a lesão ou na fase tardia da lesão nervosa.

O número de motoneurônios marcados com Fluoro-Gold pode ser utilizado para aferir a reconexão dos nervos periféricos na medula espinhal.[27] Quando avaliamos o número de motoneurônios, os valores do corno anterior da medula nos grupos Enxerto e Enx + Nat não mostraram nenhuma diferença estatística, permanecendo abaixo dos do grupo controle.

Tem sido relatado que animais submetidos à natação apresentaram regeneração nervosa acelerada em comparação a animais de controle com lesão nervosa do tipo esmagamento e o aumento do diâmetro das fibras nervosas.[8]

À semelhança dos estudos de Teodori et al.[9] e Oliveira et al.[15], o protocolo adotado aqui estabeleceu uma fase de adaptação dos animais à atividade de natação, que começa 20 minutos no primeiro dia e aumenta 10 minutos todos os dias até atingir 60 minutos no quinto dia. Esse período de adaptação permite que os animais se familiarizem com a natação, evitando tanto a acomodação física quanto o estresse. Por outro lado, existem algumas diferenças entre o protocolo utilizado no presente estudo e os demais dados presentes na literatura.

O método cirúrgico aqui adotado foi do tipo enxerto autólogo do nervo ciático, enquanto outros estudos utilizaram o esmagamento do nervo ciático[9] [16] e a transecção do nervo ciático.[11] O momento do início da intervenção aplicada foi no 14° dia após o procedimento cirúrgico, e este período foi semelhante ao do estudo de Teodori et al[9] e superior a outros protocolos que iniciaram a atividade após o 1° dia[9] [15] e o 7° dia[11] do método cirúrgico. Além disso, a duração da intervenção da natação foi superior aos estudos que aplicaram a atividade durante 2,[9] 3,[15] e 4 semanas.[11] Estas variáveis podem ter afetado a eficácia da atividade da natação na regeneração do nervo ciático.

Dessa forma, a comparação entre os resultados obtidos e os achados da literatura é uma medida complexa, pois não existe homogeneidade quanto à metodologia aplicada, à técnica cirúrgica, ao tempo de início do protocolo, à intensidade, à frequência, e aos métodos de aferição.

Conclusões

Nosso estudo demonstrou que os animais submetidos ao protocolo de natação após o procedimento de enxerto do nervo ciático não apresentaram diferenças nos valores de IFC e nos números de motoneurônios quando comparados ao grupo controle. Concluímos que este tipo de protocolo descrito não é eficiente para reabilitação de lesões nervosas periféricas que necessitam de enxerto. Novos estudos são necessários para avaliar métodos que acelerem e melhorem os resultados funcionais após o procedimento de enxerto do nervo ciático.

Estudo realizado com animais. Segue aprovação (CEUA n° 5060051217).

Conflict of Interests

The authors have no conflict of interests to declare.

^* Trabalho desenvolvido no Departamento de Ortopedia e Traumatologia da Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil

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