Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Analyse von Onkogen-Veränderungen beim Nierenzellkarzinom

Zusammenfassung

Mitglieder der ras-Gen-Familie sind in verschiedenen menschlichen Karzinomen als Onkogene aktiviert. Urn die Rolle, die diese Mutationen bei der Karzinogenese von Nierenzellkarzinomen spielen, zu untersuchen, haben wir Tumor-DNA und gesundes Nierengewebe von 55 Patienten auf diese Mutationen untersucht. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde hierbei verwendet, um DNA-Fragmente zu amplifizieren, die die Kodons 12, 13 und 61 der Ki-, Ha- und N-ras-Onkogene enthielten. Die amplifizierten Fragmente wurden auf Nylonmembranen mittels Slot-Blot-Technik transferiert und mit radioaktiv markierten spezifischen Oligomeren geprobt. In Misch-Experimenten konnten wir zeigen, daß eine Mutation in heterogenem, aus mutierten und nicht mutierten Zellen bestehendem Gewebe entdeckt werden kann, wenn es wenigstens 20 % an mutierten Zellen enthält. Außerdem ist es möglich, auch sogenannte “degenerierte Oligomergemische”, die spezifisch für bis zu 6 verschiedene Mutationen sind, zu verwenden, ohne wesentlich an Sensitivität zu verlieren. Dies erlaubt rasche “Screening”-Untersuchung großer Mengen an verschiedenen Tumorproben. Eine neue Methode zur (semi-) quantitativen DNA-Messung, die “differentielle PCR” wird verwendet, um nach chromosomalen Deletionen in Tumorgewebe zu suchen. In den von uns untersuchten 55 Nierenzellkarzinomen konnte lediglich eine Ki-ras-Mutation (Kodon 12, Glycin-Valin) in einem Patienten mit pT2 N2 M1-Tumor entdeckt werden. Daraus folgern wir, daß ras-Onkogen-Mutationen bei der Initiierung von Nierenzellkarzinomen keine entscheidende Rolle spielen können.

Abstract

Members of the ras gene family are activated as oncogenes in many different human cancers. To determine systematically the frequency at which such genes might be involved in the development of renal cell carcinoma, we analyzed tumor DNA and unaffected renal tissue derived from 55 patients. The polymerase chain reaction technique was used to amplify DNA fragments containing Kirsten (Ki-), Harvey (Ha-), and N-ras codons 12, 13, and 61. The amplified fragments were then probed on slot-blots with labeled mutation-specific oligomers. In mixing experiments we were able to demonstrate that a mutation can be detected when the tissue contains at least 20 % of tumor cells. Hereby, degenerate oligonucleotide probes specific for up to six different possible mutations can be used in the same experiment, allowing rapid screening of large numbers of tumor samples. Additionally, a “differential PCR” method is established to rapidly screen for chromosomal deletions in tumor probes. In our collection of 55 renal cell carcinoms a single Ki-ras mutation (codon 12, glyval) was detected in a patient with a pT2 N2 M1 tumor. We conclude that ras oncogene mutations do not play an important role in the initiation of renal cell carcinoma.

Key words

Polymerase chain reaction (PCR) - Oncogenes - Renal cell carcinoma - Ras oncogene mutations