Phosphorylierung von Klasse II Histondeacetylasen durch Proteinkinase D2 (PKD2) erfordert spezifische posttranslationale Modifikationen der Kinase

Einleitung: PKD2 ist eine Serin-Threoninkinase und gehört zur Proteinkinase D Familie. Die katalytische Aktivierung von PKDs erfolgt u.a. durch G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). PKD2 ist in unterschiedlichen subzellulären Kompartimenten wie Golgi-Apparat, Zytoplasma und Zellkern lokalisiert.

Ziele: In dieser Arbeit untersuchten wir, welche posttranslationalen Modifikationen an PKD2 notwendig sind, um ein nukleäres Substrat, Histondeacetylase 7 (HDAC7) zu phosphorylieren.

Methodik: Die Identifizierung der durch Gastrin in AGS-B Magenkarzinomzellen induzierten Serinphosphorylierung von PKD2 erfolgte mittels tandem LC-MS/MS. Die subzelluläre Lokalisation von PKD2 wurde mit eGFP-Fusionsproteinen und konfokaler Lasermikroskopie bestimmt. Zur funktionellen Analyse der identifizierten Serinphosphorylierungsstellen wurden phosphomimetrische Mutanten der eGFP-PKD2 Fusionsproteine eingesetzt. Die Analyse der Substratphosphorylierung erfolgte mittels in vitro Kinaseassays.

Ergebnis: Unsere Daten zeigen, dass PKD2 in Magenkarzinomzellen nach Stimulation des CCK-2-Rezeptors mit Gastrin selektiv an drei Serinresten phosphoryliert ist. Zwei Serine befinden sich im activation loop der Kinase. Diese Phosphorylierungen werden durch PKCs vermittelt und sind für die katalytische Aktivität des Proteins notwendig. Eine weitere, durch Casein Kinase 1 (CK1) vermittelte Serinphosphorylierung in der Zinkfingerdomäne beeinflusst die Aktivtät der Kinase nicht, retiniert aber PKD2 im Zellkern. Aktive PKD2, die nicht im Zellkern lokalisiert ist, phosphoryliert HDAC7 nur geringfügig. Dagegen induziert die an allen 3 Serinresten phosphorylierte Kinase eine maximale Phosphorylierung/Inaktivierung von HDAC7 und konsekutiv die spezifische Induktion von Nur77.

Schlussfolgerung: Die Funktion von PKD2 wird Kompartiment-spezifisch reguliert. Nur die aktive Kinase, die auch nukleär lokalisiert ist, induziert die optimale Phosphorylierung des nukleären Substrats HDAC7 und führt zur konsekutiven Derepression von Nur77, einem Regulator der Proliferation von Tumorzellen. Durch spezifische Blockade der Akkumulation von PKD2 im Zielkompartiment kann somit eine wesentliche Funktion der Kinase selektiv ausgeschaltet werden, ohne dass die katalytische Funktion des Proteins generell gehemmt wird.