Z Gastroenterol 2005; 43 - P239
DOI: 10.1055/s-2005-920019

Leberspezifische Genexpression mittels synthetisch generierter neuartiger composite-Promotoren

MLC Lemken 1, WA Wybranietz 2, U Schmidt 1, UM Lauer 1
  • 1Universitätsklinikum Tübingen, Abt. Innere Medizin 1, Tübingen
  • 2Privat, keine Institutszugehoerigkeit

Zielsetzung:

Gewebespezifische Promotoren ermöglichen eine gezielte gewebespezifische Expression therapeutischer Gene und erfüllen damit ein wichtiges Sicherheitskriterium in der Gentherapie.

Konstitutiv aktive Promotoren zellulärer house keeping Gene oder organspezifische regulatorische Sequenzen im Kontext viraler Vektoren erzielen häufig nur unzureichende Expressionsniveaus und können gleichzeitig nicht die erforderliche funktionale Gewebespezifität sicherstellen. Einen alternativen Ansatz stellt die synthetische Generierung gewebespezifischer Promotoren dar.

Um eine starke leberspezifische Genexpression zu erreichen, wählten wir synergistisch wirkende transaktivierende leberspezifische Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen aus und generierten synthetische Promotor/Enhancer-Elemente, die mit einem sog. Minimal-Promotor (HSV-TK –37 Basisvektor) kombiniert werden.

Methoden:

Zunächst wurden composite-Elemente der leberspezifischen Gene Apo B100 (Apolipoprotein B100) und OTC (Ornithin-Transcarbamoylase) PCR-amplifiziert und in Form von Monomeren und Oligomeren in das Expressionsplasmid pGreen2 kloniert, welches die neuartige Reportergenfusion EGFP-Neor enthält. Zur Ermittlung der Gewebespezifität wurden humane Hepatomzellinien (HuH7, Hep3B, HepG2) sowie Nicht-Hepatomzellinien (293, HeLa) mit diesen Plasmiden transfiziert und die transkriptionelle Aktivität mittels FACS-Analyse, Western-Blot und RT-PCR ermittelt.

Ergebnisse:

Die FACS-Analyse zeigte eine quantifizierbare Expression des Reporter-Proteins EGFP in allen humanen Hepatomzellinien (HuH7, Hep3B, HepG2), nicht aber in den Kontroll-Zellinien (293, HeLa). Das 4fach-Multimer bzw. das 8fach-Multimer der composite-Elemente der leberspezifischen Gene Apo B100 und OTC erwiesen sich als die Konstrukte mit der höchsten gewebespezifischen Genexpression.

Schlussfolgerungen:

Es ist uns gelungen, Multimere aus composite-Elementen der leberspezifischen Gene Apo B100 und OTC zu generieren, welche eine lebergewebespezifische Expression des Reporter-Proteins EGFP ermöglichen. Aufgrund des hohen Kompaktheitsgrades dieser synthetisch erzeugten Promotorkassetten eröffnen sich vielfältige neuartige Einsatzmöglichkeiten im Bereich der leberspezifischen therapeutischen Genexpression.

Keywords: Leber-Gentherapie, Leberspezifische Genexpression, synthetische Leber-spezifische Promotoren