Z Gastroenterol 2005; 43 - 2_02
DOI: 10.1055/s-2005-861615

Synthetisch generierte neuartige composite-Promotoren ermöglichen leberspezifische Genexpression

MLC Lemken 1, U Schmidt 1, UM Lauer 1, WA Wybranietz 2
  • 1Medizinische Klinik I, Universität Tübingen, Tübingen
  • 2Privat

Hintergrund und Zielsetzung

Die gezielte gewebespezifische Expression therapeutischer Gene stellt in der in vivo Gentherapie einen wichtigen Sicherheitsfaktor dar. Eine Möglichkeit, die Genexpression auf die Zielzellen zu beschränken, liegt in der Wahl gewebespezifischer Promotoren. Virale Vektoren mit konstitutiv aktiven Promotoren zellulärer house keeping Gene oder organspezifischen regulatorischen Sequenzen erzielen häufig nur unzureichende Expressionsniveaus und können gleichzeitig nicht die erforderliche funktionale Gewebespezifität sicherstellen. Einen alternativen Ansatz stellt die synthetische Generierung gewebespezifischer Promotoren dar. Um eine starke leberspezifische Genexpression zu erreichen, wählte unsere Arbeitsgruppe synergistisch wirkende transaktivierende leberspezifische Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen aus und generierte synthetische Promotor/Enhancer-Elemente, die mit einem sog. Minimal-Promotor (HSV-TK–37 Basisvektor) kombiniert werden.

Methoden

Zunächst wurden über PCR composite-Elemente der leberspezifischen Gene Apo B100 (Apolipoprotein B100) und OTC (Ornithin-Transcarbamoylase) generiert und in Form von Monomeren und Oligomeren in das Expressionsplasmid pGreen2 kloniert, welches die neuartige Reportergenfusion EGFP-Neor enthält. Zur Ermittlung der Gewebespezifität dieser Genregulationselemente wurden humane Hepatomzellinien (HuH7, Hep3B, HepG2) sowie Nicht-Hepatomzellinien (293, HeLa) mit diesen Plasmiden transfiziert und die transkriptionelle Aktivität mittels FACS-Analyse, Western-Blot und RT-PCR ermittelt.

Ergebnisse

Mittels FACS-Analyse lies sich eine quantifizierbare Expression des Reporter-Proteins EGFP in allen humanen Hepatomzellinien (HuH7, Hep3B, HepG2), nicht aber in den Kontroll-Zellinien (293, HeLa), nachweisen. Das 4fach-Multimer bzw. das 8fach-Multimer der composite-Elemente der leberspezifischen Gene Apo B100 und OTC erwiesen sich als die Konstrukte mit der höchsten gewebespezifischen Genexpression.

Schlussfolgerungen

Es ist uns gelungen, Multimere aus composite-Elementen der leberspezifischen Gene Apo B100 und OTC zu generieren, welche eine lebergewebespezifische Expression des Reporter-Proteins EGFP ermöglichen. Aufgrund des hohen Kompaktheitsgrades dieser synthetisch erzeugten Promotorkassetten eröffnen sich vielfältige neuartige Einsätzmöglichkeiten im Bereich der leberspezifischen therapeutischen Genexpression.

Key words

Gentherapie - leberspezifische Genexpression - leberspezifische Promotoren