Molekulare Grundlagen der Zellzyklus-abhängigen Expression des Pankreaskarzinom assoziierten Proteins ZAP90

ZAP90 ist ein Mitglied einer neuen Familie proliferations-assoziierter Proteine. Immunhistochemische Untersuchungen zeigen eine vermehrte Expression in humanen duktalen Pankreaskarzinomen. Yeast-Two-Hybrid Experimente ergaben eine spezifische ZAP90-pRb Interaktion und führten zur Identifizierung weiterer potentielle Interaktionspartner (hDaxx, Ribonukleotidreduktase, Cytokeratin 18). ZAP90-Promoteranalysen ergaben funktionell aktive Elk/Ets-Elemente und Zellzyklus-assoziierte Regulationselemente. Ziel der vorliegenden Untersuchung war die molekulare Charakterisierung der Zellzyklus-abhängigen ZAP90 Expression. Methoden: Zur Analyse der Proteinexpression wurde ein monoklonaler ZAP90-Antikörper entwickelt und induzierbare ZAP90-GFP-Expressionsplasmide kloniert. Die immunhistochemische Auswertung erfolgte mit einem Laser-Scanning Mikroskop. Transient transformierte und nicht transformierte Zellen wurden mit Hilfe von Mimosin (G1/S), Thymidin (S) oder Nocodazol (G2/M) in den entsprechenden Zellzyklus-Phasen arretiert und die ZAP90-Genexpression mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie oder der Durchflusszytometrie charakterisiert. Die AKT-ZAP90 Interaktion wurde mit spezifischen Inhibitoren und siRNA untersucht. Ergebnisse: Der monoklonale Antikörper zeigt sowohl in Formalin- als auch in Alkohol-fixierten Tumorzellen in der Mitose-Phase eine starke ZAP90-Expression. Mit Hilfe der Laser-Scanning-Mikroskopie konnte eine retikuläres-zytoplasmatisches Muster mit einer perinukleären Akkumulation nachgewiesen werden. In Coimmunfluoreszenz-Experimenten zeigte sich eine Übereinstimmung mit der intrazellulären pRb und CDK4 Verteilung. Die Analyse der Zellzyklus-abhängigen Expression ergab in der Durchflusszytometrie und in der Fluoreszenzmikroskopie eine Akkumulation von ZAP90 in der G2/M-Phase. Im Gegensatz dazu führte der Arrest in der G1/S- oder S-Phase zu keiner Veränderung des ZAP90-Expressionsmusters. Diskussion: Zusammen mit dem Expressionsmuster, dem induzierten Phänotyp, den Promoteranalysen und den bisher charakterisierten Interaktionspartnern weist die Akkumulation am G2/M-Checkpoint und die Interaktion mit dem AKT Pathway auf eine wichtige funktionelle Rolle von ZAP90 im Rahmen der humanen Pankreaskarzinogenese hin

Key words

AKT - Retinoblastoma - Yeast-Two-Hybrid - siRNA