Funktioneller Assay für p53 auf der Basis eines neuen DNA-Reparatur-Nachweisverfahrens

Zielsetzung: Die Bedeutung des Tumorsuppressor-Proteins p53 ergibt sich aus der Tatsache, dass es in 50–60% aller Krebsarten durch Mutation bzw. Deletion ausgeschaltet wird. p53 reguliert das Wachstum und induziert die Apoptose durch transkriptionelle Anschaltung von Zielgenen. Gleichzeitig hält p53 die Genomstabilität durch Überwachung der DNA-Reparatur aufrecht. Gemäß dieser multiplen Funktionen von p53 ist es erstrebenswert, nicht nur das Expressions-Niveau, sondern den diagnostisch weit aussagekräftigeren funktionellen Status von p53 in Tumoren festzustellen.

Material und Methoden: Erfolgreiche DNA-Reparatur wurde über die Reaktivierung der intensiven Autofluoreszenz des EGFP-Proteins nachgewiesen. Dies bedeutet, dass der einfache Nachweis von grünfluoreszierenden unter nichtfluoreszierenden Zellen als Maß für Reparatur-Effizienz verwendet und über einfache FACS-Zytometrie quantifiziert wurde.

Ergebnisse: Ein neuartiges Testverfahren wurde eingesetzt, um distinkte DNA-Reparatur-Prozesse qualitativ und quantitativ zu erfassen. Die vergleichende Analyse der Aktivitäten von Wildtyp-p53 und bei Krebspatienten vorkommenden p53-Mutanten ergab, dass letztere bzgl. ihrer Fähigkeit, rekombinative DNA-Reparatur zu regulieren, starke Defekte aufwiesen. Hierbei ist hervorzuheben, dass von den transkriptionellen Aktivitäten des Tumorsuppressors vermittelte Funktionen von dieser genomstabilisierenden Wirkung separiert werden konnten, also ein direkter Mechanismus nachweisbar war.

Zusammenfassung: In dieser Arbeit setzten wir einen neuartigen zellulären Assay ein, welcher mit kurzen Reaktionszeiten die Analyse von rekombinativen DNA-Reparatur-Ereignissen ermöglicht. Für p53-Hotspot-Mutanten entdeckten wir mit diesem Verfahren eine überraschend gute Korrelation zwischen dem Reparatur-Defekt des Proteins und der Häufigkeit, mit welcher die jeweilige Mutante beim Patienten auftaucht. Dies bedeutet, dass ein einfacher Test generiert wurde, von welchem im Vergleich zu mikroskopischen Techniken gute Vorhersagen zur Funktionalität von p53 erwartet werden.