In vitro test-system for chemo- and thermosensitivity: an analysis of survival fractions and cell-cycle distributions in human Ewing's sarcomas as a model
for tumors in Pediatric Oncology

Abstract

Background: Tumor cell resistance to anticancer drugs is the primary reason for treatment failure in childhood cancer. Resistance can exist at the onset of treatment or can become clinically apparent under selective pressure of drug exposure. In vitro predictive tests are important for the experimental study of drug resistance. Although in vitro studies appear to be fairly good for predicting drug resistance, they are rarely used in the routine management of individual cases. An exception that proves the rule is the MTT- (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazoliumbromide) assay in children with acute lymphoblastic leukemias (ALL), which can be correlated with the clinical outcome in this group of patients [16] [28]. In the present study we used a predictive test-system to evaluate the synergistic cytotoxic effects of chemotherapy ± hyperthermia with respect to cell cycle disturbance. Methods: As a tumor model two well defined human Ewing's sarcoma cell lines VH64 and SK-ES-1 were treated for 1 h with cis-diamminedichloroplatinum II (cDDP) (0.1, 0.5, 1, 3, 5 µg/ml) or 4'-demethyl-epipodophyllotoxin-5-(4,6-0-)-ethylidene-β-D-glycopyranoside (VP-16) (1, 5, 10, 20, 50 µg/ml) ± hyperthermia (42 °C, 43 °C); control: 37 °C, without chemotherapy. Cell survival was tested using the XTT- (2,3-bis[2-Methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carbo-xanilide) assay [31]. Assay conditions were optimized for each tumor cell line, extinction was measured 72 h post treatment at 450 nm in an ELISA-reader. Cell cycle fractions (G0/G1-, S-, G2/M-phase) were determined immediately, 12 h and 24 h after treatment by labeling proliferating tumor cells with bromodeoxyuridine (BrdU) and measuring DNA-content with propidium-iodide (PI) and analyzed by flow cytometry [4]. Results: Survival fractions: Hyperthermia alone at 43 °C reduced tumor cell survival to 51 % in SK-ES-1 and 74 % in VH64. cDDP (5 µg/ml): reduction of survival fraction to 23 % in SK-ES-1 and 33 % in VH64. cDDP (5 µg/ml) + hyperthermia (43 °C): enhanced reduction of tumor cell survival compared to 37 °C to 11 % in SK-ES-1 and 8 % in VH64. VP-16 (50 µg/ml): survival fraction of 18 % in SK-ES-1 and of 31 % in VH64. In contrast to cDDP, chemosensitivity of the tumor cells to VP-16 could not synergistically be enhanced by using hyperthermia. Cell cycle analysis: Hyperthermia alone at 43 °C induced an accumulation in G2/M and a slight reduction in G0/G1-phase 24 h after treatment, whereas the S-phase was not markedly affected. cDDP (5 µg/ml) alone led to a prominent S-phase arrest and a G0/G1 decrease 24 h after treatment. Simultaneous application of cDDP (5 µg/ml) + hyperthermia (43 °C) however significantly reduced S-phase cells. VP-16 (50 µg/ml) alone induced a temporary S-phase arrest 12 h after treatment and a delayed G2/M-arrest after 24 h. Additional hyperthermia at 43 °C did not show further effects on VP-16 induced cell cycle disturbances. Conclusions: Test-system discloses treatment-specific alterations in tumor cell survival and cell cycle distribution, e. g. synergistic enhancement of cDDP cytotoxicity by heat application, which might predict chemo- and thermosensitivity.

Zusammenfassung

Hintergrund: Die Resistenzphänomene von Tumorzellen gegenüber Chemotherapie sind der wichtigste Grund für die Unwirksamkeit von Behandlungsmaßnahmen bei bösartigen Erkrankungen im Kindesalter. Solche Resistenzen können primär zu Therapiebeginn bereits vorhanden sein oder durch den selektiven Einfluss einer Zytostatikaeinwirkung klinisch auffällig werden. Im Rahmen von experimentellen Studien haben prädiktive In-vitro-Tests zur Untersuchung von Chemotherapie-Resistenzen große Bedeutung erlangt. Obwohl In-vitro-Untersuchungen zur Vorhersage von Chemotherapie-Resistenzen grundsätzlich geeignet sind, finden diese in der standardmäßigen Behandlung von Einzelfällen nur selten Anwendung. Eine Ausnahme in dieser Gesamtsituation ist durch den MTT-Test bei Kindern mit akuter lymphatischer Leukämie (ALL) gegeben, der in dieser Patientengruppe mit dem klinischen Behandlungsverlauf korreliert werden kann [16] [28]. In der vorliegenden Studie ist ein prädiktives Testsystem bei Tumorzellen zur Anwendung gekommen, um synergistische zytotoxische Effekte von Chemotherapie ± Hyperthermie unter Berücksichtigung von Veränderungen im Zellzyklus zu evaluieren. Methoden: Als Tumormodell wurden zwei genau charakterisierte Ewing-Sarkom-Zelllinien VH64 und SK-ES-1 eingesetzt, die für 1 Stunde mit cDDP (0,1, 0,5, 1, 3, 5 µg/ml) oder VP-16 (1, 5, 10, 20, 50 µg/ml) ± Hyperthermie (42 °C, 43 °C) behandelt wurden; Kontrolle: 37 °C, ohne Chemotherapie. Die Anzahl der überlebenden Tumorzellen wurde mit Hilfe des XTT-Tests bestimmt [31]. Die Testbedingungen wurden für die jeweilige Tumorzelllinie optimiert und die Extinktion 72 Stunden nach der Behandlung bei 450 nm am ELISA-Reader gemessen. Die einzelnen Zellzyklusphasen (G0/G1-, S-, G2/M-Phase) wurden direkt, 12 und 24 Stunden nach der Behandlung durch Markierung von proliferierenden Tumorzellen mit Bromdesoxyuridin (BrdU) und Bestimmung des DNA-Gehaltes mit Propidiumjodid (PI) analysiert und am Durchflusszytometer ausgewertet [4]. Ergebnisse: Überlebensfraktionen: Die alleinige Hyperthermiebehandlung bei 43 °C reduzierte die Tumorzellzahl auf 51 % in SK-ES-1 bzw. 74 % in VH64. cDDP (5 µg/ml) führte zu einer Reduktion der Überlebensfraktion auf 23 % in SK-ES-1 bzw. 33 % in VH64. cDDP (5 µg/ml) + Hyperthermie (43 °C) konnte die Reduktion der Tumorzellen im Vergleich zu 37 °C auf 11 % in SK-ES-1 bzw. 8 % in VH64 verstärken. VP-16 (50 µg/ml) verminderte die Überlebensfraktion auf 18 % in SK-ES-1 bzw. auf 31 % in VH64. Im Gegensatz zu cDDP konnte die Chemosensitivität der Tumorzellen gegenüber VP-16 durch Hyperthermie nicht synergistisch verstärkt werden. Zellzyklus-Analyse: Die alleinige Hyperthermiebehandlung bei 43 °C induzierte eine Akkumulation von Zellen in der G2/M-Phase und eine leichte Reduktion in der G0/G1-Phase 24 Stunden nach der Behandlung, wohingegen die S-Phase nicht merklich beeinflusst wurde. cDDP (5 µg/ml) führte zu einem deutlichen S-Phase-Arrest und einer G0/G1-Abnahme 24 Stunden nach Behandlung. Gleichzeitige Applikation von cDDP (5 µg/ml) + Hyperthermie (43 °C) dagegen verursachte eine signifikante Reduktion von S-Phase-Zellen. VP-16 (50 µg/ml) induzierte einen vorübergehenden S-Phase-Arrest nach 12 und einen verzögerten G2/M-Arrest nach 24 Stunden. Zusätzliche Hyperthermie bei 43 °C zeigte keinen maßgeblichen Einfluss auf die durch VP-16 induzierten Zellzyklusveränderungen. Schlussfolgerungen: Das In-vitro-Testsystem ermöglicht einen Einblick in behandlungsbedingte Veränderungen des Überlebens und der Verteilung im Zellzyklus von Tumorzellen im Sinne einer thermischen Wirkungsverstärkung von cDDP. Das Testsystem könnte somit zur Vorhersage von Chemo- und Thermosensitivität geeignet sein.

Key words

Ewing's tumor - cDDP - VP-16 - Hyperthermia - XTT-assay - Cell cycle

Schlüsselwörter

Ewing-Sarkom - cDDP - VP-16 - Hyperthermie - XTT-Assay - Zellzyklus

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