Histomorphometrische Bestimmung des Wachstumsverhaltens von Spiralganglienzellneuriten in vitro

Zusammenfassung

Hintergrund: Während der letzten Jahre wurden verschiedene Gruppen von Wachstumsfaktoren identifiziert, die konzentrations- und zeitabhängig das Zellüberleben und die Neuritenaussprossung von Spiralganglienzellen der Säugetiercochlea beeinflussen. Zur Bestimmung von Unterschieden des Wirkungsspektrums dieser Faktoren sind exakte histomorphometrische Analysen erforderlich. Für die Auswertung des Wachstumsverhaltens, insbesondere für die Bestimmung der Länge der Neuriten, finden sich in der Literatur sehr unterschiedliche Methoden, die nur näherungsweise die Neuritenlänge beschreiben.

Methode: Es wurde eine Software auf der Basis von Borland Delphi® entwickelt, mit der digitalisierte Bilder der Spiralganglienzellen gelesen und einzelne Neuriten manuell vermessen werden können. Die Neuriten werden in ihrem Verlauf in beliebig viele Einzelstrecken zerlegt und deren Beträge dann im Sinne eines Polygonzuges addiert. Diese Methode wurde mit einem bereits angewandten semi-quantitativen Messverfahren verglichen und die Genauigkeiten beider Techniken bestimmt. Die Anwendung beider Verfahren zur Ausmessung der Neuritenlänge erfolgte an 20 Spiralganglienexplanaten der neugeborenen Ratte nach in vitro-Stimulation mit dem Wachstumsfaktor Neurotrophin-3.

Ergebnisse: Im Vergleich zur semi-quantitativen Methode, die eine Längenbestimmung der Spiralganglienzellneuriten mit einer Genauigkeit von etwa ± 10 - 15 % erlaubt, liegt der systematische Fehler bei dem Polygonverfahren bei ca. ± 1 %.

Schlussfolgerung: Mit der vorgestellten Methode lassen sich die Wachstumsmuster von Spiralganglienzellneuriten nach Zellkulturuntersuchungen sehr genau quantifizieren und die Unterschiede im Wirkungsspektrum verschiedener neurotropher Faktoren bestimmen.

Abstract

Background: During the last years, various groups of growth factors have been identified to influence spiral ganglion cell survival and neurite extension in the mammalian cochlea. To evaluate and compare the effects of different growth factors, a precise histomorphometrical analysis of neurite outgrowth patterns has to be applied. The here presented technique is compared to already published methods, that only approximately estimate the neurite length.

Method: A software has been developed to analyse digitalised scans of spiral ganglion cells and to measure the length of the neurites. Therefore, the neurites are being separated in any given number of straight lines. The totals of these lines can then be added like a polygon. This polygon method was compared to a semi-quantitative procedure in which the neurite length was determined by concentric circles that were crossed by the neurites in a certain distance. The accuracy of both methods was analysed. Both methods were performed in 20 specimen of neonatal rat spiral ganglion cells after in vitro stimulation with neurotrophic factors.

Results: The semi-quantitative method has shown to involve a systematic error between ± 10 to 15 %. The polygon method, on the contrary, has a systematic error of around ± 1 %, which admits much more accurate measurement of spiral ganglion neurite outgrowth.

Conclusion: With the described polygon method, spiral ganglion neurite growth patterns in cell culture studies can be characterised more precisely and, thus, helps to better differentiate the action domain of neurotrophic factors.

Schlüsselwörter

Histomorphometrie - Spiralganglion - Neuritenwachstum - Zellkultur - Innenohr

Key words

Histomorphometry - Spiral ganglion - Neurite growth - Cell culture - Inner ear

Literatur

• 1 Avila M A, Varela-Nieto I, Romero G, Mato J M, Giraldez F, Van De Water T R, Represa J. Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons.  Dev Biol. 1993;  159 266-275
• 2 Garrido J J, Alonso M T, Lim F, Carnicero E, Giraldez F, Schimmang T. Defining responsiveness of avian cochlear neurons to brain-derived neurotrophic factor and nerve growth factor by HSV-1-mediated gene transfer.  J Neurochem. 1998;  70 2336-2346
• 3 Sokolowski B H. Quantitative analysis of long-term survival and neuritogenesis in vitro: cochleovestibular ganglion of the chick embryo in BDNF, NT-3, NT-4/5, and insulin.  Exp Neurol. 1997;  145 1-15
• 4 Lefebvre P P, Van de Water T R, Weber T, Rogister B, Moonen G. Growth factor interactions in cultures of dissociated adult acoustic ganglia: neuronotrophic effects.  Brain Res. 1991;  567 306-312
• 5 Dazert S, Kim D, Luo L, Aletsee C, Garfunkel S, Maciag T, Baird A, Ryan A F. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro.  J Cell Physiol. 1998;  177 123-129
• 6 Aletsee C, Volter C, Brors D, Ryan A F, Dazert S. (Effect of fibroblast growth factor-1 [FGF-1] on spiral ganglion cells of the mammalian cochlea).  HNO. 2000;  48 457-461
• 7 Dazert S, Baird A, Ryan A F. Receptor-targeted delivery of an intracellular toxin to outer hair cells by fibroblast growth factor.  Hear Res. 1998;  115 143-148
• 8 Ebendal T. Use of collagen gels to hioassay nere growth factor activity. Nerve Growth Factors. In: Rush RA (Ed) Nerve Growth Factors. Bath; Wiley 1989: 81-93
• 9 Steiner J P, Hamilton G S, Ross D T, Valentine H L, Guo H, Connolly M A, Liang S, Ramsey C, Li J H, Huang W, Howorth P, Soni R, Fuller M, Sauer H, Nowotnik A C, Suzdak P D. Neurotrophic immunophilin ligands stimulate structural and functional recovery in neurodegenerative animal models.  Proc Natl Acad Sci USA. 1997;  94 2019-2024
• 10 Borasio G D, Horstmann S, Anneser J M, Neff N T, Glicksman M A. CEP-1347/KT7515, a JNK pathway inhibitor, supports the in vitro survival of chick embryonic neurons.  Neuroreport. 1998;  9 1435-1439
• 11 Hossain W A, Rutledge A, Morest D K. Critical periods of basic fibroblast growth factor and brain-derived neurotrophic factor in the development of the chicken cochleovestibular ganglion in vitro.  Exp Neurol. 1997;  147 437-451
• 12 Staecker H, Kopke R, Malgrange B, Lefebvre P, VandeWater T R. NT-3 and/or BDNF therapy prevents loss of auditory neurons following loss of hair cells.  Neuroreport. 1996;  7 889-894
• 13 Gratton M A, Schulte B A, Hazen-Martin D J. Characterization and development of an inner ear type 1 fibrocyte cell culture.  Hear Res. 1996;  99 71-78
• 14 Kawa A, Stahlhut M, Berezin A, Bock E, Berezin V. A simple procedure for morphometric analysis of processes and growth cones of neurons in culture using parameters derived from the contour and convex hull of the object.  J Neurosci Methods. 1998;  79 53-64
• 15 Bilsland J, Rigby M, Young L, Harper S. A rapid method for semi-quantitative analysis of neurite outgrowth from chick DRG explants using image analysis.  J Neurosci Methods. 1999;  92 75-85
• 16 Dazert S, Schomig P, Shehata-Dieler W E, Aletsee C, Dieler R. (An anesthesia technique for experimental studies and microsurgical ear interventions in newborn rodents).  Laryngo-Rhino-Otol. 2000;  79 26-29
• 17 Isaacs K R;, Jacobowitz D M. A method for the rapid analysis of neuronal proportions and neurite morphology in primary cultures.  Exp Neurol. 1998;  149 464-467