Rolle des PlGF bei chorioidaler Neovaskularisation in Mäusen

Das VEGF System hält eine große Zahl verschiedener Metabolite bereit, die pro- als auch anti-angiogen und zusätzlich inflammatorisch wirken können. Diese Wirkungen werden durch die verschiedenen Rezeptoren vermittelt, wobei der VEGF-Rezeptor-1 (VEGFR1) eine besondere Rolle spielt. Er kann durch verschiedene Agonisten aktiviert werden und daher sehr unterschiedliche Wirkungen haben. Der Plazenta-Wachstumsfaktor (placenta growth-factor = PlGF) ist der spezifische Agonist des VEGFR1. Jüngere Publikationen wiesen auf eine Rolle des PlGF in der chorioidalen Neovaskularisation (CNV) hin, die jedoch noch noch nicht vollständig geklärt ist. Der VEGFR1 wird im Wesentlichen von Endothelzellen als auch von Makrophagen exprimiert. Daher haben wir die Rolle des PlGF in der Laser-induzierten CNV unter der Hypothese, dass PlGF die begleitende Aktivierung von Makrophagen/Mikroglia via Interaktion mit VEGFR1 koordiniert, im Mausmodell untersucht.

CNV wurde in MacGreen (Csf1r-EGFP) Mäusen durch Laserbehandlung mit 5 Spots (Argon Laser, 120mW, 50 µm, 100 ms) induziert. Interventionen bestanden in intraokulären Injektionen von Aflibercept, anti-PlGF- Antikörper oder PBS als Injektionskontrolle. Untersuchung der Mikroglia Aktivität bezüglich Morphologie und räumlich-zeitlicher Verteilung erfolgten in vivo durch SLO und ex vivo in Flatmount Präparaten, gefärbt gegen Iba-1 oder GFP. Genexpressionsprofile per qPCR dienten zur Analyse der M1/M2 Makrophagen Differenzierung und dem Nachweis inflammatorischer oder angiogener Faktoren. PlGF und VEGF-A Expression wurde in Sagittalschnitten und Flatmount-Präparaten nachgewiesen.

PlGF mRNA stieg schon am ersten Tag nach Laserbehandlung (D1) stark an, um nach 4 Tagen auf den Normalwert wieder abzusinken, wobei demgegenüber die VEGF-A Expression unverändert blieb. Am Tag 14 nach Laser konnte VEGF-A in den Sagittalschnitten nur im Bereich der Lasernarben beobachtet werden, wohingegen PlGF eher homogen über die Netzhaut verteilt nachweisbar war. Ähnlich wie PlGF ist es zu einer großflächigen Aktivierung von Mikroglia sogar in Arealen, die weit von den Laser-Spots entfernt sind, gekommen. Dabei kam es zu einer Differenzierung in Richtung M1 Phänotyp (CD68 und CD86 Hochregulation). Eine Differenzierung in den M2 Typ konnte nicht beobachtet werden. In den Interventionsstudien hat sich Aflibercept gegenüber der alleinigen Gabe von anti-PlGF Antikörpern oder PBS durch eine größere Verminderung der Mikroglia Aktivierung und damit durch verstärkte Hemmung der CNV Ausbildung durchsetzen können. Bei der alleinigen Gabe von anti-PlGF Antikörpern konnte die Mikroglia Aktivierung vermindert werden, jedoch wurde kein hemmender Effekt auf die CNV Bildung gegenüber PBS gemessen.

Abb. 1: obere Reihe: Sagittalschnitt der Retina gefärbt mit einem Antikörper gegen VEGF-A (rot). Peripherie (links), rechts im Bereich der Lasernarbe. Kernfärbung:DAPI. Die VEGF-A Expression ist auf den Bereich der Lasernarbe beschränkt.
untere Reihe: Sagittalschnitt der Retina gefärbt mit einem Antikörper gegen PlGF (rot). Links Peripherie, rechts im Bereich der Lasernarbe. Kernfärbung: DAPI. PlGF ist im Bereich der Lasernarbe als auch in ungelaserten Arealen im Bereich der äußeren plexiformen Schicht nachweisbar.

Zusammenfassend erscheint PlGF an einer frühen und über die innere Netzhaut gleichmäßig verteilten Mikroglia Aktivierung als Reaktion auf den Laser-Impact in der äußeren Netzhaut beteiligt zu sein. Zum ersten Mal konnten wir zeigen, dass es bei der Ausbildung von lokalen Netzhautschäden zu einer Reaktion der ganzen Netzhaut kommt, die in der PlGF-gesteuerten Aktivierung von Mikroglia besteht. In der nun folgenden Studie wollen wir untersuchen, welche Gene durch VEGFR1 Stimulation in Makrophagen induziert werden und untersuchen, welchen Anteil hierzu die PlGF-abhängige Stimulation des VEGFR1 im Vergleich zu seiner Stimulation durch VEGF-A beiträgt. Da beide Agonisten VEGFR1 stimulieren, soll in Interventionsstudien die Effektivität zur Hemmung der Laser-CNV in unterschiedlichen Kombinationsapplikationen untersucht werden: Aflibercept Monotherapie versus anti-VEGF-A Monotherapie versus Kombinationstherapie anti-PlGF/anti-VEGF-A vs. Aflibercept + anti-PlGF.

Abb. 2: links: SLO Fundusautofluoreszenz-Sequenz vor Laserintervention und an Tag 7 und 14 (obere Reihe anti-PlGF, untere Reihe Aflibercept). Die Verwendung von MacGreen Mäusen ermöglicht die Detektion von mononukleären Phagozyten mittels Csf1r-EGFP. rechts: Co-staining gegen Csfr1 (grün) and PlGF (rot) in Retina-Flachpräparaten. Mononukleäre Phagozyten im Bereich der Lasernarbe in anti-PlGF(obere Reihe) und Aflibercept (untere Reihe) injizierten Tieren.