Sequenzierung von Hotspotmutationen in zellfreier DNA (cfDNA) von Patienten mit gastrointestinalen Tumoren mittels modularen Amplicon Panels

Einleitung: Durch Apoptose und Nekrose freigesetztes genomisches Material ist in geringen Konzentrationen als zellfreie DNA (cfDNA) im Plasma nachweisbar. Die Menge an cfDNA ist bei Patienten mit gastrointestinalen Tumoren häufig erhöht und enthält genomische DNA des Tumors. Die Sequenzierung dieser cfDNA ermöglicht es, ein genetisches Profil des Primarius sowie der Metastasen zu erstellen ohne eine Gewebeprobe entnehmen zu müssen.

Ziele: Etablierung einer Methode zur gezielten Untersuchung von Mutationen in cfDNA durch Amplicon-Sequenzierung mit modularen Hotspot-Panels.

Methodik: EDTA-Blut wurde von Patienten mit gastrointestinalen Tumoren entnommen, das Plasma durch Zentrifugation isoliert und bei -80 C° eingelagert. Die cfDNA wurde mittels Qiagen Blood Mini Kit extrahiert und die DNA Konzentration mittels Qubit 2.0 (Life Technologies) quantifiziert. Zur Analyse der Mutationsfrequenzen von Hotspot-Genen wurde ein Panel mit 48 Amplicons erstellt. Die Amplicon-Primer wurden mit Primer3 entworfen. Die Zielsequenzen wurden mittels two-step PCR und Primer-Multiplexing amplifiziert. Die Sequenzierung der Amplikons erfolgte auf einem Illumina MiSeq.

Ergebnis: Aus unserem Studienkollektiv hatten Patienten mit metastasiertem kolorektalem Karzinom (mCRC, n = 35) im Mittel 16,2 ng DNA pro ml Plasma. 40% der Patienten hatten Metastastasen in mehr als einem Organ und 40% erhielten eine Zweitlinientherapie oder eine höhere Therapielinie. Die cfDNA aus vier Patienten mit mCRC sowie genomische DNA der kolorektalen Karzinomzelllinie HCT116 wurden zur Überprüfung des Amplicon Panels verwendet. Alle bekannten Mutation in HCT116, die durch das Panel abgedeckt sind, wurden in der Sequenzierung gefunden. In der cfDNA konnten Punktmutationen in Tumor-assoziierten Genen (PIK3CA, TP53, MSH6 und KIT) mit einem Anteil mutierter Allele zwischen 2 – 85% nachgewiesen werden.

Schlussfolgerung: Unsere ersten Daten zeigen, dass mit dieser Methode Hotspotmutationen in cfDNA von Patienten mit gastrointestinalen Tumoren analysiert werden können. Der Vorteil dieses Ansatzes gegenüber kommerziell erhältlichen Cancer Panels ist die Möglichkeit, dass das zu untersuchende Mutationsspektrum auf spezifische Fragestellungen oder eine bestimmte Tumorentität angepasst werden kann.