Die p53-Familie steuert die Apoptosesuszeptibilität der Zelle durch Regulation von Mcl-1

Hintergrund: Die p53-Familie von Transkriptionsfaktoren besteht aus den überwiegend homolog aufgebauten Familienmitgliedern p53, p63 und p73. Diese nehmen abhängig von ihren Splice-Varianten – mit Transaktivierungs-(TA)domäne oder trunkiert (dominant negativ; DN, ΔN) – tumorsuppressive oder onkogene Funktionen im Zellzyklus wahr. Das Hepatozellulläre Karzinom (HCC) ist eine Komplikation der Leberzirrhose, welche die Prognose der Erkrankung deutlich limitiert. In Vorarbeiten wurde über Transduktion der immortalisierten HCC-Zelllinie Hep3B mit rekombinanten Adenoviren (rAd-p53, rAd-TAp63 oder rAd-TAp73) und anschließender Microarrayanalyse das Gen für Myeloid cell leukemia sequence 1 (Mcl-1) als potentielles Zielgen der p53-Familie identifiziert. Ein Vergleich mit klinischen Daten eines Sets von 139 HCC-Patienten bestätigte zudem die prognostische Relevanz dieses Gens für den Verlauf der Tumorerkrankung. Mcl-1 ist ein Mitglied der Bcl-2-Proteinfamilie, welche die Integrität der Mitochondrien kontrolliert. Mcl-1 gehört hierbei zur Gruppe der anti-apoptototischen Bcl-2-Proteine, die das Überleben der Zelle durch Bindung und Inhibition pro-apoptotischer Bcl-2-Proteine fördern. Inwiefern die Funktion von Mcl-1 durch die p53-Familie reguliert wird, war bisher nicht bekannt und wurde in dieser Arbeit untersucht.

Methoden: Nach den Kriterien von Riley et al. (Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2008) zur Verifikation von p53-Zielgenen wurde MCL1 auf Interaktion mit der p53-Familie untersucht. Hep3B-Zellen wurden mit rAd-GFP, rAd-p53, rAd-TAp63α, rAd-TAp73ß, rAd-ΔNp63α und rAd-ΔNp73ß transduziert. Die MCL1-Expression wurde anschließend mittels real-time qPCR bestimmt. Nach spezifischer siRNA-Interferenz zur Blockierung der jeweiligen Splice-Varianten wurden intrazelluläre Proteinmengen von Mcl-1 anhand von Western Blots untersucht. Mittels Datenbankanalyse (pDraw32, Husar und Match^TM) erfolgte die Identifizierung potentieller Bindungsstellen der p53-Familie am MCL1-Gen. Zur Verifizierung dieser putativen Bindungsstellen wurden Luciferase-Assays durchgeführt. Über LUminescence-based Mammalian IntERactome mapping (LUMIER) wurden direkte Protein-Interaktionen von Mcl-1 mit der p53-Familie bestimmt.

Ergebnisse: p53 und die mit einer Transaktivierungsdomäne ausgestatteten Isoformen TAp63 und TAp73 führten zu einer Inhibition der MCL1-Expression, während ΔNp63α und ΔNp73ß die MCL1-Expression induzierten. Diese Ergebnisse wurden auf Proteinebene bestätigt. Durch Silencing von p53, TAp63 und TAp73 wurde die reduzierte Mcl-1-Produktion durch diese Varianten aufgehoben. Die Datenbankanalysen von pDraw 32, HUSAR und Match^TM identifizierten jeweils zwei potentielle Bindungsstellen für p53 sowie jeweils eine potentielle Bindungsstelle für p63 in Promotor, Intron 1 und Intron 2. Luciferase-Assays dieser klonierten putativen Bindungsstellen bestätigten das Muster der beobachteten Regulation von MCL1 durch die p53-Familie. Darüber hinaus konnte mittels LUMIER-Assay eine direkte Protein-Protein-Interaktion zwischen Mcl-1 und p53 sowie TAp63 nachgewiesen werden.

Schlussfolgerung: MCL1 wird direkt durch die p53-Familie reguliert. Hierbei wirken p53 sowie TAp63 und TAp73 als Repressoren, während die trunkierten Isoformen DNp63 und DNp73 eine erhöhte MCL1-Expression induzieren. Darüber hinaus findet post-translational eine Interaktion von Mcl-1 und p53 sowie TAp63 statt. Da Mcl-1 anti-apoptotisch wirkt und das Zellüberleben fördert, führt die Herunterregulation des MCL1-Gens durch TA-Isoformen der p53-Familie zur Steigerung der Apoptosesuszeptibilität der Zelle. Beim HCC besteht häufig eine chemotherapeutische Resistenz, welche durch Rekonstitution von p53, TAp63 und TAp73, aber auch durch direkte Blockierung von Mcl-1 durchbrochen werden könnte.