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DOI: 10.1055/s-0035-1555464
hMLH1 vermittelt die Interaktion von hMutLα und hMutLβ mit hMutSα
Hintergrund/Einleitung: Die Korrektur von Fehlern bei der Replikation der DNA (Mismatches) erfolgt durch ein konserviertes System (Mismatch Reparatur), welches für die Replikationsgenauigkeit bei der DNA-Synthese entscheidend ist. Beim Menschen wird die Korrektur vor allem durch die Proteinheterodimere hMutSa (hMSH2-hMSH6) und hMutLa (hMLH1-hPMS2) initiiert. Defekte in diesem System stellen die Grundlage für das hereditäre nicht-polypöse kolorektale Karzinom (HNPCC) dar.
Zielsetzung: Ein DNA-Replikationsfehler wird im Zellkern von hMutSa erkannt. Dieses bindet an den fehlerhaften DNA-Bereich, interagiert mit hMutLa und signalisiert hierdurch dem zellulären Reparaturkomplex den Korrekturbedarf. In dieser Arbeit sollte die Interaktion zwischen hMutSa und hMutLa, welche den Reparaturprozess initiiert, genauer charakterisiert werden.
Material und Methoden: Es wurde ein Assay entwickelt, mit dem anhand von DNA, die an magnetische Partikel gebunden wurde, die Komplexbildung zwischen hMutSa und hMutLa aus Proteinextrakten verschiedener Zelllinien untersucht werden konnte. Die Komplexbildung mit hMutL Heterodimeren liess sich aufgrund der Bindungszunahme nach ATP-Zugabe nachweisen. Die Proteine wurden nach der Inkubation mit Salzlösung eluiert und mittels Western Blot-Technik qualitativ und quantitativ erfasst.
Ergebnisse: Anhand der vorliegenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass hMutSa fester an Heteroduplex- als an Homoduplex-DNA bindet. ATP verringert die Affinität von MutSa zu DNA (verringerte Salzresistenz des MutSa/DNA-Komplexes), wobei immer noch eine Präferenz für Heteroduplex-DNA besteht. MutLa und hMutLß (hMLH1 und hPMS1) bilden nach ATP-Zugabe (1–10µM) mit hMutSa einen Komplex auf der DNA. Dies geschieht nur auf längeren DNA-Fragmenten (81 mer vs. 32 mer). Die MutL Bindung ist MutSa abhängig und wird durch die Untereinheit MLH1 vermittelt.
Schlussfolgerung: Die entwickelte Methodik ist geeignet, um die initialen Schritte der Mismatch-Reparatur (Bindung der Proteine an DNA, Bindung an Fehler und Komplexbildung von hMutSa und hMutLa) zu untersuchen. Die Methodik erlaubt es, Veränderungen in den Proteinen bezüglich ihrer Auswirkungen auf die initialen Schritte zu bewerten. Hierdurch könnte auch eine funktionelle Bewertung von Mutationen bei Patienten mit HNPCC erfolgen.