Beeinflusst die N34S-Mutation des pankreatischen Trypsinihibitors SPINK1 dessen subzelluläre Lokalisation?

Hintergrund/Einleitung: Die N34S-Mutation des pankreatischen Trypsininhibitors SPINK1 ist mit verschiedenen Formen der chronischen Pankreatitis assoziiert. Dies sind die „normale“ chronisch alkoholische, die ideopathische und ihre tropische Form. Wir konnte durch Experimente in der Zellinie AR4–2J zeigen, dass die N34S-Mutante im Gegensatz zum Wildtyp durch intrazelluläre Trypsinaktivität ausgelösten Zelltod nicht inhibieren konnte.

Zielsetzung: Untersuchung des Mechanismus der vermuteten „loss of function“-Mutation N34S des pankreatischen Trypsininhibitors SPINK1 durch Studien der subzellulären Lokalisation von Wildtyp und Mutante

Material und Methoden: Die cDNA von SPINK1 wurde mittels PCR aus einer pankreatischen cDNA Bank amplifiziert und in den Vektor pcDNA3 subkloniert. N-terminal führten wir ein HA-tag ein. Die N34S-Mutation wurde mittels „side directed mutagenesis“ eingeführt. Hela und AR4–2J Zellen wurden transient mit den Plasmiden transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen für die anschließende Immunhistochemie mit einem HA-Antikörper fixiert. Es erfolgte die Gegenfärbung mit einem Antikörper gegen beta-COP, einem Marker für den Golgi-Apparat. Die Analyse mittels konfokaler Lasermikroskopie durchgeführt.

Ergebnisse: Die Expression von Wildtyp SPINK1-HA in Hela-Zellen fand sich perinukleär, also in einer für den Golgi-Apparat typischen Lokalisation. Bei Gegenfärbung mit einem Antikörper gegen beta-COP zeigte sich größtenteils eine Kolokalisation in Vesikeln. In AR4–2J Zellen fand sich Immunreaktivität für den HA-tag in runden Vesikeln, die in der Gegenfärbung ebenfalls beta-COP positiv waren. In beiden Zelltypen fand sich kein Unterschied zwischen Wildtyp und N34S-Mutante.

Schlussfolgerung: Mittels konfokaler Lasermikroskopie haben wir die subzelluläre Verteilung von Wildtyp SPINK1-HA oder dessen N34S-Mutation in Hela und AR4–2 Zellen untersucht. Immunreaktivität kolokalisierte mit einen Marker für den Golgi-Apparat. Es fand sich kein Unterschied zwischen Wildtyp und Mutante. Unsere Daten scheinen auszuschießen, dass der von uns hypothetisierte Funktionsverlust durch die N34S-Mutation durch Beeinflussung der subzellulären Lokalisation des Inhibitors verursacht wird. Weitere Studien mit rekombinaten Proteinen sind nötig, um den Mechanismus dieser Mutation zu klären.