Analyse von Genen mit Cisplatin-Resistenz-assoziierter Hypermethylierung in Ovarialkarzinomzelllinien

Einleitung: Die adjuvante Standard-Chemotherapie bei Ovarialkarzinompatientinnen enthält Platin. Obwohl anfänglich 80% der Patientinnen ein klinisches Ansprechen zeigen, entwickeln die meisten von ihnen ein Pt-resistentes Rezidiv. Bei diesem Prozess sind, neben neu erworbenen genetischen Aberrationen auch epigenetische Veränderungen von Bedeutung. Ziel dieser Studie ist die Untersuchung von Genen, deren Promotor während der in-vitro Pt-Resistenz-Entwicklung im Zellkulturmodell hypermethyliert wird.

Methoden: Resistente Subklone der Zelllinien A2780, SKOV3 und HeyA8 wurden durch langzeitige Kultivierung unter stufenweise steigender Cisplatinkonzentration generiert. Hypermethylierte CpG Inseln wurden, nach Anreicherung von methylierter DNA aus sensitiven bzw. resistenten Zellkulturen (MIRA-Methylated CpG-Island Recovery Assay), mittels vergleichender Microarrayhybridisierung identifiziert und durch methylierungsspezifische PCR validiert. Die Bestimmung der Expression von hypermethylierten Genen erfolgte mittels real-time PCR. Die funktionelle Bedeutung hypermethylierter Gene wurde durch Überxpression in resistenten bzw. shRNA-vermittelten knock-down in sensitiven Zellen ermittelt.

Ergebnisse: Microarray-Analysen identifizierten 37 CpG Inseln die während der Resistenzentwicklung in allen 3 Zelllinienpaaren hypermethyliert wurden. Dabei zeigten vier von 25 analysierten Genen eine verringerte Expression in den resistenten Zellen. Insbesondere wiesen sensitive Zellen eine erhöhte Expression während der Cisplatinexposition in Abhängigkeit von der Konzentration und Behandlungsdauer auf. Bisherige Überexpressionsexperimente zeigen teilweise eine veränderte Sensitivität auf Cisplatin für die transfizierten Zellen. Dies wird sowohl anhand von Einzelzellklonen als auch shRNA Experimenten validiert.

Schlussfolgerung: Die Entwicklung von Cisplatinresistenz in-vitro ist mit der Hypermethylierung von CpG-Inseln und der einhergehenden Hemmung der Expression betroffener Gene assoziiert. Erste funktionelle Daten weisen diesen Vorgängen auch eine funktionelle Bedeutung zu, die jedoch weitergehend validiert werden muss.