Biochemische Charakterisierung der Carnitin Palmityltransferase (CPT) bei muskulärem CPT II-Mangel

Der muskuläre CPT II- Mangel ist gekennzeichnet durch rezidivierende Attacken von Myoglobinurie, häufig mit Myalgie oder Muskelsteifigkeit, ausgelöst durch längere körperliche Belastung, Fasten oder fieberhafte Infekte (1). Die biochemischen Konsequenzen der krankheitsauslösenden Mutation sind umstritten. Die Hypothesen reichen von einem völligen oder partiellen Mangel an enzymatisch aktivem Protein (2), einer verminderten Stabilität des Enzympoteins (3) bis zu einer abnormen Regulierbarkeit eines ansonsten normal aktiven Enzymproteins (4).

Muskelbiopsien von neun Patienten mit genetisch gesichertem CPT II- Mangel wurden zur biochemischen Charakterisierung der CPT I und CPT II mittels biochemischer Aktivitätsmessung im Muskelhomogenat, immunhistochemischer Darstellung, sowie Proteinquantifizierung im Western Blot und ELISA untersucht.

Die CPT Gesamtaktivität war nicht signifikant unterschiedlich bei Patienten und Kontrollen. Die Restaktivität nach Hemmung mit Malonyl- CoA und Triton X-100 war bei Patienten deutlich erniedrigt (Tab. 1). Die CPT II wurde immunhistochemisch (Abb. 1) und im Western Blot mit gleicher Intensität bei Patienten und Kontrollen dargestellt. Im ELISA fanden sich bei Patienten und Kontrollen keine signifikanten Unterschiede der CPT I und CPT II- Proteinkonzentrationen. Die Citratsynthaseaktivität bezogen auf den Proteingehalt war bei Patienten deutlich erhöht, die CPT II- Konzentration als auch die CPT- Gesamtaktivität normiert für die Citratsynthaseaktivität erniedrigt.

Die Daten deuten darauf hin, dass (i) die normale CPT- Gesamtaktivität bei Patienten mit muskulärem CPT II- Mangel nicht durch eine kompensatorisch erhöhte CPT I- Aktivität bedingt ist, dass (ii) das mutierte CPT II- Enzymprotein unter optimalen Testbedingungen enzymatisch aktiv und in normaler Menge vorhanden ist und dass beim muskulären CPT II- Mangel (iii) Enzymaktivität und Proteingehalt nicht reduziert, jedoch abnorm inhibiert sind wenn der Fettsäuremetabolismus gestresst ist.

Tab. 1: CPT- Gesamtaktivität (CPT I und CPT II) und Citratsynthaseaktivität im Muskelhomogenat von Patienten und Kontrollen. Angegeben sind Mittelwerte ± SD

Enzymaktivität	Patienten (n = 9)	Kontrollen (n = 18)	P
CPT- Gesamtaktivität
[nmol x min1 x mg NCP-1] [nmol x min1 x gFG-1]	2.8 ± 1.5 194.6 ± 43.3	1.9 ± 0.6 225.7 ± 61.5	ns ns
Restaktivität [%]
nach Malonyl-CoA nach Triton X-100	8.1 ± 7.1 11.5 ± 6.4	32.6 ± 4.8 45.9 ± 6.6	< 0.001 < 0.001
Citratsynthaseaktivität
[nmol x min1 x mg NCP-1] [nmol x min1 x gFG-1]	165 ± 53.1 13 ± 4.4	85.7 ± 23.3 10.1 ± 3.3	< 0.001 ns
CPT/Citratesynthase
[nmol x min1 x mg NCP-1] [nmol x min1 xgFG-1]	16.4 ± 5.9 15.0 ± 6.3	23.3 ± 6.9 22.4 ± 8.6	0.017 0.027

Abb. 1: Immunhistochemische Darstellung der CPT II bei Patient und Kontrolle. Die CPT II konnte bei Patienten (B) und Kontrollen (A) in gleicher Intensität dargestellt werden. Darstellung der Immunoreaktivität überwiegend in Typ- I Fasern, durch MHC- slow- Färbung (C).

Literaturverzeichnis:

1. Deschauer M, Wieser T, Zierz S. Muscle carnitine palmitoyltransferase II deficiency: clinical and molecular genetic features and diagnostic aspects. Archives of neurology. 2005;62(1):37 – 41.

2. Vladutiu GD, Saponara I, Conroy JM, Grier RE, Brady L, Brady P. Immunoquantitation of carnitine palmitoyl transferase in skeletal muscle of 31 patients. Neuromuscular disorders: NMD. 1992;2(4):249 – 59.

3. Olpin SE, Afifi A, Clark S, Manning NJ, Bonham JR, Dalton A, et al. Mutation and biochemical analysis in carnitine palmitoyltransferase type II (CPT II) deficiency. Journal of inherited metabolic disease. 2003;26(6):543 – 57.

4. Zierz S, Engel AG. Regulatory properties of a mutant carnitine palmitoyltransferase in human skeletal muscle. European Journal of Biochemistry. 1985;149: 207 – 14.