Verschiedene Acetylierungsmuster beeinflussen das Translokationsverhalten von FOXO1

Hintergrund: FOXO1 ist ein in humanen Zellen ubiquitär exprimierter Transkriptionsfaktor, welcher an der metabolischen und Energiehomöostase, der Proliferation und dem Schutz vor oxidativem Stress maßgeblich beteiligt ist. Die korrekte und spezifische Funktion von FOXO1 wird dabei durch posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung, Acetylierung und Sumoylierung sichergestellt. Während die Phosphorylierung von Ser265 als Gatekeeper für die Dissoziation von FOXO von der DNA und damit seiner Inaktivierung wohlbekannt ist, ist bisher weitgehend unklar, welchen Einfluss verschiedene Acetylierungsmuster haben. Das Ziel der vorliegenden Studie ist die Erforschung verschiedener Acetylierungsmuster hinsichtlich ihres Einflusses auf Lokalisation und Aktivität von FOXO.

Methoden: Ein FOXO Translokationsassay wurde etabliert, in dem ein C-terminal mit GFP gekoppeltes FOXO1 temporär in HepG2 (humane Hepatom-Zelllinie) und stabil in U-2OS (humane Osteosarkom-Zelllinie) transfiziert, konstitutiv exprimiert und fluoreszenzmikroskopisch in Echtzeit detektiert wurde. Durch zielgerichtete Mutagenese wurden verschiedene Konstrukte erzeugt, bei denen Lysin zu Arginin mutiert ist, um deacetylierte Positionen zu simulieren. Nukleärer Export wurde durch 100 nmol/l Insulin, nukleärer Import durch 50 µmol/l Resveratrol oder Luteolin bewerkstelligt.

Ergebnisse: Während die nukleäre Extraktion des w.t. FOXO1-GFP mit 100 nmol/l Insulin in ca. 10 Minuten erfolgte, dauerte dies bei einem Konstrukt, in dem Lysin 245, 248 und 265 zu Arginin mutiert waren unter ansonsten gleichen Bedingungen ca. 30 Minuten. Interessanterweise translozierte ein Konstrukt mit Mutationen von Lysin 245 und 265 zu Arginin, langsamer ins Zytosol als das w.t. FOXO1-GFP und akkumulierte anschließend perinukleär. Der Wildtyp und die mutierten Konstrukte re-translozierten durch Zugabe von Resveratrol oder Luteolin stabil in den Kern. Die Mutation von K274R und K294R resultierte in einem zeitlich vergleichbaren nukleären Export von FOXO1-GFP nach Zugabe von 100 nmol/l Insulin wie beim Wildtyp. Eine Zugabe von Luteolin bewirkte einen Reimport des K274R/K294R Konstruktes. Im Unterschied zu allen zuvor getesteten Konstrukten, re-translozierte dieses jedoch nach ca. 20 min. in das Zytosol ohne dass ein zusätzlicher Stimulus nötig war.

Zusammenfassung: Die Untersuchungen unterstützen die Hypothese, dass die Acetylierung von FOXO1 dessen Phosphorylierung vereinfacht und zu einer beschleunigten Dissoziation von FOXO1 von der DNA führt und damit auch zu einem schnelleren nukleären Export. Konstrukte, bei denen mehrere Acetylierungsstellen mutiert waren, wiesen eine verzögerte Translokation auf. Spezifische Acetylierungsmuster scheinen zudem die subzelluläre Lokalisation von FOXO1 zu beeinflussen. Daher könnte die Analyse des FOXO-Acetylierungsmusters ein wertvolles Werkzeug sein, um Informationen über die aktuelle Funktion von FOXO1 und den metabolischen Zustand der Zelle erhalten.