Effekt von Endoglin auf die Differenzierung und das Signalling in einer neuen Col-GFP-exprimierenden immortalisierten murinen Sternzell-Linie

Hintergrund: Im Rahmen der Leberschädigung differenzieren ruhende hepatische Sternzellen (HSCs) in aktivierte Myofibroblasten (MFB). TGF-β und der auxiläre Rezeptor Endoglin (ENG) sind wichtige Zytokine, die hierbei zelluläre Signale vermitteln. Murine Sternzell-Linien sind ein wichtiges Werkzeug um hepatische Sternzellen in vitro zu untersuchen.

Methoden: HSCs wurden von Collagen α1(I)-GFP Mäusen, in denen die GFP Expression durch den Collagen α1(I) Promoter/Enhancer kontrolliert wird, isoliert. Nach Aktivierung exprimieren diese HSCs Collagen und GFP. Primäre HSCs wurden mit einem SV40 large T-Antigen exprimierenden retroviralen Vektor infiziert. Die Charakterisierung der immortalisierten Zellen erfolgte durch Immunfluoreszenz-Untersuchungen für Desmin, αSMA und Glial fibrillary acidic protein (GFAP), weiterhin wurde die Expression von in aktivierten HSCs hochregulierten Genen mittels qPCR analysiert. Die Zellen wurden in 96-Well Kulturschalen plattiert, mit dem antifibrotischen Chemokine CXCL9 stimuliert und die GFP-Expression wurde mit einem Fluoreszenz Reader analysiert. Außerdem wurden die Zellen mit verschiedenen Liganden, die in der Fibroseentwicklung eine wichtige Rolle spielen, stimuliert und der Effekt auf das intrazelluläre Signalling analysiert.

Ergebnisse: Die immortalisierten Zellen exprimieren typische HSC-Marker wie Desmin, αSMA und GFAP. Collagen α1(I)-, αSMA- und GFAP-mRNA ist in den Zellen hochreguliert. Die GFP Expression korreliert mit der Zellproliferation und kann mit einem Fluoreszenz-Reader nachgewiesen werden. Stimulation mit CXCl9 (100ng/mL) zeigt eine signifikante Abnahme (-10%; p=0.0049) der GFP Expression, welche mit einer verminderten Zellproliferation einher geht. Immortalisierte HSCs können durch verschiedene Liganden, die an der Vermittlung der Leberfibrose beteiligt sind, stimuliert werden. Allerdings, am ehesten durch die starke Aktivierung der Zellen und der hohen Collagen-Promotor-Aktivität, zeigte TGF-β1 keinen signifikanten Effekt auf die GFP Expression. Transient überexprimiertes Endoglin hat einen differentiellen Effekt auf die Signaltransduktion in diesen Zellen. So ist die Aktivierung des Smad1/5/8-Signalwegs deutlich verstärkt, weiterhin vermittelt ENG die Phosphorylierung von ERK1/2. Die Expression von Vimentin, α-SMA und Connective tissue growth factor wird durch ENG hochreguliert. Interessanterweise induziert ENG die Expression von Id2 (inhibitor of differentiation-2) während die Menge des endogenen Collagen Typ 1 reduziert wird.

Schlussfolgerung: Mit den Collagen α1(I)-GFP exprimierenden immortalisierten murinen Sternzellen kann die in vitro Analyse von HSCs durch das Monitoren der GFP-Expression vereinfacht werden. Der Einfluss von regulatorischen Proteinen (z.B. Endoglin) auf zelluläre Signaltransduktionswege und Proliferation kann in diesen Zellen untersucht werden. Weiterhin können diese Zellen in vivo für Celltracing Experimente genutzt werden.