Identifizierung von neuen microRNA-Zieldomänen während der myofibroblastischen Transdifferenzierung von hepatischen Sternzellen durch "Next Generation Sequencing"

Hintergrund: Myofibroblastische Hepatische Sternzellen (HSC), die die Hauptproduzenten extrazellulärer Matrix nach einer chronischen Leberschädigung darstellen, zeigen ein verändertes Wachtumsfaktorenprofil mit deutlicher Expression von neuronalen Mediatoren. Da miR–125b, miR–128 und miR–9 in der neuronalen Genexpression involviert sind, sollte deren Rolle während der HSC Transdifferenzierung untersucht werden. Für unsere Untersuchungen haben wir einen neuen Ansatz gewählt, in welchem miRNA-Transkript-Komplexe isoliert und durch "Deep Sequencing" identifiziert wurden. Methoden: Die Expression neuronaler miRNAs wurde mittels Real-Time PCR in verschiedenen Stadien der myofibroblastischen Transdifferenzierung primärer HSC analysiert. Myofibroblastische HSC der Zelllinie HSC-T6 wurden mit miR–9, miR–125b, und miR–128 bzw. der jeweils korrespondierenden Inhibitor-miRNA transfiziert. Nach 12h wurden die miRNA-Transkript-Komplexe durch Ago2-Immunopräzipitation aufgereinigt, die RNA der Ago2-Aggregate isoliert, dann prä-amplifiziert und für den "Next Generation Sequenzierung" (NGS)-Ansatz (Illumina) verwendet. Für die bioinformatische Analyse wurde das Programm Partek Genomics Suite eingesetzt. Resultate: Während der Transdifferenzierung von HSC waren die miR–9, miR–125b und miR–128 zunehmend exprimiert. Die Transkriptomanalyse der Ago2 gebundenen mRNA mithilfe des NGS-Ansatzes identifizierte ein weites Spektrum an mRNAs in miR–9, miR–125b, und miR–128 behandelten HSC. Interessanterweise wurden in den miR–128 transfizierten HSC mRNA-Mitglieder der Chemokinfamilie als Zieldomänen der Genregulation identifiziert. Um die Bindung der miRNA an die Transkripte funktionell zu zeigen, wurden die Transkriptbereiche durch Reporter -Assays untersucht. Schlussfolgerung: Die durch Ago2-Immunopräzipitation und NGS identifizierten Zieltranskripte sprechen für eine entscheidende Rolle der neuronaler miR–9, miR–125b und miR–128 während der myofibroblastischen Differenzierung von HSC.