Eine einfache Methode zur Analyse der mRNA-, Protein- und Lipid-Zusammensetzung des Trachealepithels der Maus

Für das bessere Verständnis von Signaltransduktionswegen im Atemwegsepithel nach Kontakt mit Allergenen und Bakterien in situ als auch in vivo, wurde eine einfache Methode zur Analyse der Expression von RNA, Proteinen und Lipiden aus dem Epithel der Trachea der Maus entwickelt. Aus der explantierten murinen Trachea wurden die Zellen des Atemwegsepithels durch vorsichtiges Abschaben mit einem sterilen Tupfer entnommen. Anschließend wurde Gesamt-RNA isoliert und die Expression verschiedener Gene mittels quantitativer Real-Time RT-PCR bestimmt. Außerdem wurden Proteine isoliert und mittels Western Blot untersucht. Die Analyse des Lipid-Gehaltes und dessen Zusammensetzung erfolgte mittels micro-HPLC ESI FT-ICR Massenspektrometrie. Zur Kontrolle der Epithelgewinnung wurde die Trachea nach Epithelabtragung fixiert und mittels Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie beurteilt. Um den Einfluss von Lipopolysacchariden (LPS) auf das Epithel zu untersuchen, wurden explantierte murine Tracheen in mit LPS versetzter Hepes-Ringer-Lösung für 2,5h bei 37°C inkubiert. In der Elektronenmikroskopie war zu erkennen, dass nur das Epithel abgenommen und kein subepitheliales Gewebe geschädigt wurde. Insgesamt konnten aus dem Epithel einer einzelnen Trachea ca. 500ng Gesamt-RNA extrahiert werden. Mittels quantitativer RT-PCR konnten Transkripte für Clarazell-Protein 10 (exprimiert in sekretorischen Zellen), Forkhead box J1 (exprimiert in zilientragenden Zellen) und Cytokeratin 5 (exprimiert in Basalzellen) nachgewiesen werden. Ebenfalls mittels RT-PCR konnte ein signifikanter Anstieg von IL-6 mRNA nach LPS-Stimulation detektiert werden. Durch Western Blot gelang der Nachweis unterschiedlicher Proteine wie NF-kB und ß-Aktin. Die Massenspektrometrie ermöglichte es, mehr als 65 verschiedene Lipidspezies, einschließlich Sphingolipide, zu identifizieren und zu quantifizieren. Mit dieser einfachen Methode der Isolation des Epithels wird es möglich sein, Signaltransduktionsprozesse im Atemwegsepithel nach Kontakt mit Allergenen und Bakterien auf RNA-, Protein-, und Lipidebene zu untersuchen.