Z Gastroenterol 2010; 48 - P355
DOI: 10.1055/s-0030-1263795

Proteinkinase D2 reguliert Sekretion in humanen neuroendokrinen Tumorzellen via Interaktion mit α-SNAP und Steuerung der SNARE-Komplexierung

U Maaß 1, JL Eismann 1, C Ruhland 1, G Adler 1, T Seufferlein 2, G von Wichert 1
  • 1Universitätsklinikum Ulm, Klinik für Innere Medizin I, Ulm, Germany
  • 2Universitätsklinikum Halle, Klinik für Innere Medizin I, Halle (Saale), Germany

Einleitung: Neuroendokrine Sekretion wird auf der Stufe der Vesikelfreisetzung aus dem Trans-Golgi-Netzwerk wesentlich durch die Proteinkinase D Familie reguliert. Für die Fusion eines Vesikels mit seiner Zielmembran ist die Ausbildung und nachfolgende Wiederauflösung heterotrimerer SNARE-Komplexe essentiell. Das Recycling der SNARE-Proteine wird unter anderem durch die ATPase NSF und das Chaperon α-SNAP bewirkt. Inwieweit die PKD2 die Freisetzung von Chromogranin A in neuroendokrinen BON-Tumorzellen mittels Regulation der SNARE-Komplexen beeinflusst, wird in der vorliegenden Studie untersucht.

Methodik: Untersuchung der Komplexierung von SNAP25 und Syntaxin (t-SNAREs) in Abhängigkeit von der Aktivität der PKD2 und α-SNAP (Koimmunopräzipitation, Pull-down-assay, FRET-basierte Fluoreszenzmikroskopie nach PKD2-/α-SNAP-siRNA-Knockdown oder Transfektion dominant negativer PKD2). Biochemische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Interaktion der PKD2 mit α-SNAP und nähere Charakterisierung über GFP-markierte PKD2-Deletionsmutanten.

Ergebnis: Die Proteinkinase D2 beeinflusst die Sekretion von Chromogranin A in humanen neuroendokrinen BON-Zellen. Ein Knockdown des Enzyms führt zu Chromogranin A-Retention in einem perinukleären Kompartiment. Als Mechanismus der Sekretionsförderung konnte eine Beteiligung der PKD2 an der Regulation von SNARE-Komplexen nachgewiesen werden. Nach siRNA-Knockdown von PKD2 und α-SNAP nimmt die Menge an Syntaxin/SNAP25-Komplexen in der Koimmunpräzipitation sowie an komplexiertem SNAP25 in einem FRET-basierten Mikroskopieverfahren zu. In Koimmunopräzipitationsexperimenten und mittels Fluoreszenzmikroskopie wurde α-SNAP als Interaktionspartner der PKD2 identifiziert. Als Bindungsstelle der PKD2 für α-SNAP konnten wir durch Verwendung GFP-markierter PKD2-Deletionsmutanten die Kinasedomäne des Enzyms in der Koimmunopräzipitation sowie fluoreszenzmikroskopisch charakterisieren.

Schlussfolgerung: Die Proteinkinase D2 ist via Interaktion mit α-SNAP am SNARE-Komplex-Recycling beteiligt und stellt einen wichtigen Regulator neuroendokriner Sekretion dar.