Fluoreszenzmikroskopische Echtzeitanalyse der glucoseinduzierten Insulinsekretion in Beta-Zellen der Maus

Fragestellung: Das Signal für die bedarfsgerechte Insulinsekretion aus den Beta-Zellen des Pankreas wird im Glucosestoffwechsel generiert. Dabei spielt die Glucoseaufnahme durch den Glucosetransporter GLUT2 und die Phosphorylierung der Glucose durch die Glucokinase eine wesentliche Rolle. Der Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration ist letztlich entscheidend für die Exozytose der Insulingranula. Die Veränderung der intrazellulären Glucosekonzentration kann durch das fluorescence resonance energy transfer-(FRET)-Sensorkonstrukt FLIPglu in Echtzeit verfolgt werden. Eine zeitliche Korrelation zwischen dem Glucosestimulus und der Insulinsekretion in Beta-Zellen ist bislang noch nicht gelungen. Es war daher das Ziel dieser Studie, die intrazelluläre Glucosehomöostase parallel zum Calciumflux und der Insulinsekretion in Beta-Zellen zu charakterisieren.

Methodik: Inselzellen wurden durch Kollagenaseverdau aus dem Pankreas von NMRI Mäusen isoliert und vereinzelt. Der Glucosesensor FLIPglu wurde durch adenovirale Transduktion exprimiert. Des Weiteren wurde eine stabil FLIPglu überexprimierende insulinsezernierende MIN6-Zelllinie verwendet. Die Zellen wurden mit Fura-2 beladen, mit Krebs-Ringer-Puffer für 40min in Abwesenheit von Glucose umströmt und dann mit 10 mM Glucose für 20min stimuliert. Die Veränderung der intrazellulären Glucosekonzentration mittels FLIPglu und die der [Ca²⁺]_i Konzentration mittels Fura-2 wurden zeitgleich fluoreszenzmikroskopisch bestimmt. Der Insulingehalt wurde im Umströmungsmedium mittels ELISA analysiert.

Ergebnisse: Der Anstieg der FRET-Effizienz des FLIPglu Sensors charakterisierte die Glucoseaufnahme der Zelle nach Stimulierung und die Abnahme nach Glucoseentzug die Glucosephosphorylierungsrate. Dabei war die Glucoseaufnahme in primären Beta-Zellen signifikant höher als in MIN6-Zellen, die Phosphorylierungsrate jedoch gleich. Dem Anstieg der intrazellulären Glucosekonzentration folgten in MIN6-Zellen mit einer zeitlichen Verzögerung von 60 sek [Ca²⁺]_i Oszillationen, begleitet von einer Erhöhung der Insulinfreisetzung in das Umströmungsmedium. In Gegenwart von 10 mM 3-O-Methylglucose war das Einsetzen der [Ca²⁺]_i Oszillationen um weitere 60 sek verzögert. Die Anwesenheit von 10 mM Mannoheptulose während der Stimulierung mit 10 mM Glucose verminderte die [Ca²⁺]_i Oszillationen sowie die Insulinsekretion signifikant.

Schlussfolgerung: Eine fluoreszenzmikroskopische Echtzeitanalyse des Glucosemetabolismus und des Calciumfluxes ist durch den parallelen Einsatz des FRET-Konstruktes FLIPglu und Fura-2möglich. Durch Einsatz von Inhibitoren konnte gezeigt werden, dass eine Verlangsamung der Glucoseaufnahme primär zu einer Verzögerung der Insulinsekretion führt. Hingegen führt eine Inhibierung des Glucosestoffwechsels zu einer Reduktion des Calciumsignals und der Insulinsekretion. Diese Technik kann zukünftig dazu beitragen, Defekte in der Stimulus-Sekretionskopplung im Typ 2 Diabetes aufzuzeigen.