Neue Substrate für In-vitro-Untersuchungen zur Inhibition von Cytochrom-P450-Enzymen durch Pflanzenextrakte

In den letzten Jahren wurden bei Mikrotiterplatten-basierten Fluoreszenz-Untersuchungen zur In-vitro-Inhibition von Cytochrom-P450-Enzymen durch Arzneipflanzenextrakte zahlreiche falsch positive und falsch negative Ergebnisse veröffentlicht. Verantwortlich für die Abweichungen ist die Messung der enzymatisch gebildeten Metaboliten in Anwesenheit der Pflanzenextrakte, welche die Fluoreszenzsignale der Metaboliten konzentrationsabhängig erniedrigen oder erhöhen. Da eine chromatographische Trennung und anschließende fluorimetrische Detektion der Metaboliten bei den bisher verwendeten Cumarin- und Resorufin-Derivaten nicht ohne weiteres möglich ist, haben wir Fluoreszenzsubstrate entwickelt, deren Metabolite eine starke Retention an Reversed-Phase-Kieselgelen aufweisen, eine günstige Enzymkinetik besitzen und sowohl fluorimetrisch als auch massenspektrometrisch empfindlich detektierbar sind.

Substrat	Km [µM]	Vmax [pmol/min/pmol CYP3A4]	CLint [µl/min/pmol]
AFMU07/01	1,6	7,7	4,8
BFC	>200	1,5 (40µM BFC)	<0,0075
Benzyloxyresorufin	38	0,3	0,0079

Bezüglich CYP3A4 besitzt AFMU07/01 aufgrund des sehr niedrigen K_m-Wertes von 1,6µM und der hohen Umsetzungsgeschwindigkeit (7,7pmol/min/pmol CYP3A4) eine wesentlich höhere Intrinsische Clearance (4,8µl/min/pmol) als die etablierten Fluoreszenzsubstrate 7-Benzyloxy-4-trifluor-methylcumarin (BFC; <0,0075µl/min/pmol) und Benzyloxyresorufin (0,0079µl/min/pmol). Aufgrund seiner günstigen enzymkinetischen Eigenschaften und der vielfältigen Detektionsmöglichkeiten (HPLC-UV, -Fluoreszenz, -MS) sind die neu entwickelten Cytochrom-P450-Substrate, wie z.B. AFMU07/01, eine interessante Alternative zu den bereits etablierten Cumarin- und Resorufin-Derivaten.