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DOI: 10.1055/s-0029-1238954
Funktionelle Evaluation unklassifizierter Varianten in den Genen BRCA1 und BRCA2
Fragestellung/Hintergrund:
In den 12 Zentren des Deutschen Konsortiums für familiären Brust und Eierstockkrebs wurden bis Januar 2009 über 6200 Indexpersonen aus Risikofamilien auf Mutationen in den Genen BRCA1 und BRCA2 untersucht. Es wurden 649 distinkte Mutationen nachgewiesen, darunter 183 unklassifizierte Varianten (UCV), deren pathogenetische Bedeutung bisher ungeklärt ist. Eine Möglichkeit der Einordnung ist die Evaluation der Doppelstrangreparatur (DSR)-Kapazität mutierter Zellen, da die BRCA Gene hier eine Schlüsselrolle spielen. Daher haben wir einen Assay etabliert, bei dem Bestrahlungsinduzierte Doppelstrangdefekte in heterozygoten Fibroblasten mittels M-FISH untersucht werden (Buchholz 2002, Kote-Jarai 2006).
Methode:
In einer Pilotstudie wurden 12 Personen eingeschlossen, darunter vier Kontrollpersonen, vier Trägerinnen einer gesicherten pathogenen Mutation in der RAD51-Bindungsdomäne des BRCA2 Gens und vier Trägerinnen einer UCV in der RAD51 Bindungsregion des BRCA2 Gens. Den Patientinnen wurde mithilfe einer Hautpunch Biopsie ein Stanzzylinder von 5mm entnommen und die dermalen Fibroblasten wurden anschließend ausgepflanzt, bis zur dritten Passage kultiviert und anschließend in Stickstoff eingefroren. Nach dem Auftauen und Kultivierung für 24 Stunden wurden die Fibroblasten mit 4Gy bestrahlt und weitere sechs Tage kultiviert, im Anschluss wurden Metaphase-Spreads angefertigt und eine M-FISH Analyse durchgeführt. Hierbei wurde die Anzahl der Chromosomenaberrationen nach einem standardisierten Verfahren bestimmt.
Ergebnisse:
Es wurden pro Person 20 Metaphasen untersucht, dabei zeigten die Trägerinnen einer pathogenen BRCA2 Mutation signifikant mehr Chromosomen-Abberrationen als die Kontrollgruppe (x2; p=0,032). Die Gruppe der UCVs verhielt sich unterschiedlich und konnte zum Teil der Kontrollgruppe und zum Teil der Gruppe der Trägerinnen einer pathogenen Mutation zugeordnet werden.
Schlussfolgerung:
Die Ergebnisse bestätigen eine Haploinsuffizienz pathogener BRCA Mutationen. Bei ausreichender Diskriminierung der pathogenen Mutationen vom Normalkollektiv ist die Klassifikation der UCVs möglich.