Effiziente Herstellung transfizierter humaner Keratinozyten unter serum- und Feederlayer-freien Bedingungen

Zusammenfassung

Fragestellung/Ziel: In der klinischen Anwendung kann eine autologe Transplantation von Keratinozyten besonders zur Behandlung von Brandwunden oder chronischen Wunden einen potenziellen Benefit für den Patienten darstellen. Die gut zu kontrollierende Applizierbarkeit der Keratinozyten und die Möglichkeit über topischen Zusatz von Induktoren auf die Genexpression direkt einzuwirken, machen Keratinozytenkulturen zu einem interessanten Vehikel für gentherapeutische Ansätze weit über eine Einwirkung auf Wundheilung hinaus. So ist eine Etablierung praktikabler und reproduzierbarer Verfahren zur Erhaltung reiner und proliferativer Kulturen eine unmittelbare Vorrausetzung um diese Therapievorteile zu nutzen. Die besten Ergebnisse mit nachfolgend reinen Keratinozyten bei fortschreitender Seneszenz wurden bislang mit sogenannten Feederlayers aus mitotisch inaktivierten Fibroblasten erzielt. Das Ziel dieser Studie war die Etablierung einer effektiven und verlässlichen Methode zur Isolation von humanen Keratinozyten. Wir stellen hier ein Verfahren vor, bei dem humane Keratinozyten ohne die Notwendigkeit eines Feederlayers in hoher Reinheit und Proliferatonsrate kultiviert werden können.

Material und Methode: Humane Keratinozyten wurden auf unbeschichtetem Plastikmaterial zunächst in modifiziertem Waymouthmedium gezogen, gefolgt von einem kommerziellen serumfreien Medium, mit den Ziel die Kontamination mit Fibroblasten zu unterdrücken. Die Zellen wurden morphologisch und mit anschließender Transfektion funktionell charakterisiert. Zur positiven Selektion der transfizierten Zellen wurde das Co-Transfektionssystem pMACS Kk und magnetic cell sorting angewendet.

Ergebnisse: Die Transfizierbarkeit, der nach dem beschriebenen Verfahren gezogenen Zellen, wurde anhand eines GFP exprimierenden Vektors ermittelt. Die erzielten Transfektionsraten lagen bei 35%. Der Einsatz des magnetic cell sorting erlaubte eine erfolgreiche positive Selektion. Nach dem sorting Verfahren erreichten de Zellen eine gute Adhärenz und setzten ihre Teilung fort. Für alle Keratinozytenkulturen konnte so eine permanente Adhärenz auf unbeschichteten Zellkulturmaterialien über 5 Passagen erreicht werden, ohne dass Anzeichen von Seneszenz beobachtet wurden und die kontinuierliche Verdopplungszeiten lagen bei 3–5 Tagen.

Schlussfolgerung: Wir beschreiben eine effiziente und simple Methode zur standardisierten Isolation von vitalen und proliferativen humanen Keratinozyten. Das hier etablierte vereinfachte Verfahren erleichtert den gentherapeutischen Einsatz und den Transfer Keratinozyten-basierter Zelltherapien in klinische Anwendungen.

Abstract

Purpose/Background: Keratinocyte transplantation after burn injury and in chronic wound treatment is a potentially useful method in clinical practice. As transfer of keratinocytes is easily monitored and gene expression is controllable by topical administration of inductors, keratinocyte cultures are an especially interesting medium for gene therapeutic approaches far above of wound healing applications. A major obstacle is the standardization of keratinocyte preparation and maintenance of pure proliferative cultures for clinical application. The best outcomes in previous protocols were obtained using fibroblasts as a feeder layer, a requirement for long-term expanded cultures. Cell expansion and a high purity of keratinocytes are prerequisites for clinical transfer studies. Here, we describe a human keratinocytes preparation method that allows cell proliferation and expansion in culture without a feeder layer.

Materials and Methods: Human keratinocytes were prepared from skin biopsies and cultured on untreated plastic culture dishes using Waymouth medium the first days followed by a change to a commercially available serum-free keratinocyte medium. The cells were characterized morphologically followed by transfection. For positive selection, transfected cells were selected by the cotransfection system pMACS Kk and magnetic cell sorting.

Results: Transfection rates were determined by expression of GFP vector which were 35%. The usage of magnetic cell sorting resulted in positive selection of transfected cells. Positive cells were able to adhere and proliferate after the sorting procedure. High viability and expansion of plastic adherent keratinocytes was achieved allowing up to 5 passages without signs of senescence and the doubling times were 3–5 days. The cells displayed typical keratinocyte morphology and immunostaining confirmed high keratinocyte purity. The number of contaminating fibroblasts was low.

Conclusion: Here, we describe an efficient and inexpensive method for a standardized human keratinocyte isolation without the need of a fibroblast feeder layer. This protocol may facilitate the clinical application of cell based therapies in burn injuries or chronic wounds using keratinocytes.

Schlüsselwörter

humane Keratinozyten - Zellexpansion - Transfektion - zellbasierte Therapien

Key words

human keratinocytes - cell expansion - transfection - cell based therapies

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