Fettsäure-induzierte Bildung von Wasserstoffperoxid in insulinproduzierenden Zellen

Fragestellung: Das metabolische Syndrom, das zur Manifestation eines T2DM führen kann, ist unter anderem durch erhöhte Konzentrationen freier gesättigter Fettsäuren gekennzeichnet. Palmitinsäure (C16:0), die physiologisch bedeutsamste gesättigte Fettsäure, hat einen ausgeprägten zytotoxischen Effekt auf insulinproduzierende Zellen. Es gibt experimentelle Hinweise, dass eine vermehrte Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) während des Fettsäurestoffwechsels von Bedeutung ist für die Lipotoxizität.

Ziele der vorliegenden Studie waren die Analyse der Palmitinsäure-induzierten ROS-Bildung mit besonderer Berücksichtigung der intrazellulären Lokalisation, sowie eine Toxizitätsanalyse unterschiedlicher gesättigter Fettsäuren in Abhängigkeit von ihrer Kettenlänge.

Methodik: Die Zellvitalität von insulinproduzierenden RINm5F-Zellen wurde nach 24stündiger Inkubation mit verschiedenen gesättigten Fettsäuren im MTT-Assay und durch Färbung mit Propidiumiodid bestimmt. Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies wurde mittels Dichlorofluorescein (DCF) in Kontroll- und Katalase überexprimierenden RINm5F-Zellen analysiert. Die Überexpression des HyPer-Proteins in RINm5F-Zellen ermöglichte eine spezifische intrazelluläre Detektion von Wasserstoffperoxid. Die Änderungen der Fluoreszenzratio nach Palmitinsäureinkubation wurden sowohl mit einem Fluoreszenzmikroskop als auch mit einem Mikrotiterplatten-Fluorometer detektiert.

Ergebnisse: Die längste analysierte Fettsäure, Stearinsäure (C18:0), hatte den stärksten zytotoxischen Effekt mit einem EC₅₀-Wert unter 100µM. Mit abnehmender Kettenlänge verminderte sich die Toxizität. So wiesen die Fettsäuren C13:0– C10:0 einen signifikant erniedrigten zytotoxischen Effekt mit EC₅₀-Werten über 500µM auf.

Palmitinsäure führte nach 24stündiger Inkubation zu einem signifikanten Anstieg der ROS-Produktion in RINm5F-Kontrollzellen im DCF-Assay. Während durch Überexpression von Katalase im Zytosol die ROS-Produktion signifikant reduziert werden konnte, war bei einer Überexpression der Katalase im Mitochondrium nur eine leichte Verminderung zu beobachten. Durch das Wasserstoffperoxid-Sensorprotein HyPer ließ sich eine Verdopplung der intrazellulären H₂O₂-Konzentration nach Palmitinsäureinkubation in RINm5F-Zellen beobachten.

Schlussfolgerungen: Die Toxizitätsanalyse in Abhängigkeit der Kettenlänge zeigte, dass nur langkettige Fettsäuren > C14:0 für insulinproduzierende Zellen toxisch sind. Der protektive Effekt der zytosolisch lokalisierten Katalase im Gegensatz zur mitochondrial lokalisierten Katalase zeigte, dass die Bildung von ROS im Zytosol und nicht im Mitochondrium von Bedeutung ist für die Lipotoxizität. Mithilfe des HyPer-Proteins konnte gezeigt werden, dass hauptsächlich Wasserstoffperoxid als reaktive Sauerstoffspezies bei der Lipotoxizität gebildet wird.